龟板活性成分调控Shh/Wnt3a信号通路诱导骨髓间充质干细胞成骨分化 -挑战杯

龟板活性成分调控Shh/Wnt3a信号通路诱导骨髓间充质干细胞成骨分化

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第十一届“挑战杯”国赛作品

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生命科学

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自然科学类学术论文

简介：

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有向成骨分化的潜能，在骨缺损修复领域具有广阔的应用前景。以中医学“肾主发育，主骨生髓”为理论依据，前期的研究表明，益肾中药龟板通过调控视黄酸受体α（RARα）与维生素D受体（VDR）两条信号通路而影响MSCs的增值和分化。本研究立足前期建立的龟板甾类成分的分离分析、质控及MSCs的成骨分化技术，免疫组化、Western blot、原位杂交、RT-PCR等方法检测成骨分化标志物ALP、OPN及VDR的表达，证实维生素D受体是龟板提取物诱导MSCs成骨分化的可能药理靶点；进一步结合计算机辅助药物设计，用分子对接的方法模拟龟板提取物中三个甾类成分（4-甾酮、十四酸甾醇酯、甾醇）与核受体VDR的相互亲和力，同时采用活性导向的标准组分模式来验证龟板中何种甾类成分是诱导MSCs成骨分化的物质基础，并用Shh信号通路的特异性抑制剂环杷(Cyclopamine)阻断Shh信号通路，探讨了引发这一生物学效应的信号通路机制。计算机模拟结果表明，4-甾酮对核受体VDR的亲和力较十四酸甾醇酯大，而后者又比甾醇大。实验结果表明，龟板活性成分4-甾酮能显著增加其钙化结节的数目，提高成骨分化标志物ALP、OPN的表达水平，并且以剂量依赖的方式促进Shh 及Wnt3a的表达，表明4-甾酮是龟板提取物诱导MSCs成骨分化的物质基础，其成骨分化的机制可能与上调信号分子Shh 及Wnt3a的表达有关。计算机模拟结果和实验结果相一致，具有可重复性。在此基础上，用Cyclopamine阻断Shh信号通路后检测发现Gli1不表达，Wnt3a略见表达，而VDR的表达组间未见明显改变，推测其成骨分化的可能机制与龟板活性小分子直接进入细胞膜作用核受体VDR，进而上调Shh的表达,激活其下游转录因子Gli1及Wnt3a信号，最终启动成骨分化有关。

详细介绍：

1 研究内容1.1 探讨龟板提取物诱导MSCs成骨分化的可能维生素D受体机制，证明VDR是龟板提取物诱导MSCs成骨分化分子药理靶点。1.2 探讨龟板提取物中诱导MSCs成骨分化的甾类物质基础，分子对接法分析龟板中三种甾类成分与核受体VDR的亲和力。1.3 利用体外MSCs成骨分化模型，采用活性导向的标准组分模式来探讨龟板提取物中何种甾类成分能诱导MSCs成骨分化，明确龟板中何种甾类成分是发挥该药效的活性成分。1.4 利用已筛选出的甾类活性成分，作用体外MSCs成骨分化模型，分析Shh、Wnt3a的表达情况，揭示这两个信号分子在MSCs成骨分化过程中可能参与的作用。1.5 利用体外MSCs成骨分化模型，用Shh信号通路的特异性阻断剂cyclopamine阻断该通路，并检测信号分子Gli1、Wnt3a、VDR的表达情况，揭示龟板诱导MSCs成骨分化的Shh/Wnt3a信号通路机制。2 拟解决的关键问题2.1 龟板中何种甾类成分具有诱导MSCs成骨分化的活性作用。2.2 龟板中活性甾类成分与Shh/Wnt3a信号通路之间的关系3 该实验分五个阶段进行：3.1 第一阶段：龟板提取物诱导MSCs成骨分化的可能维生素D受体的机制3.1.1 龟板的鉴定、提取及质控 龟板产地为海南省海口市，由广东省汕头市药材采购供应站提供，并经广州中医药大学中药学院鉴定。将龟板低温粉碎成粗粉，用递增极性溶剂石油醚、乙酸乙酯、乙醇和水分分步提取龟板，得到具有促进MSCs增殖分化作用的乙酸乙酯部位。该部位由甾类，脂肪酸及其酯组成，其中甾类成分包括4-甾酮、十四酸甾醇酯和甾醇。用GS-MS和HPLC严格质控，该研究已获得一项中药发明专利（专利号：ZL [1**********]9.9）及省成果。本实验用4-甾酮（S1）、十四酸甾醇酯（S2）、甾醇（S3）三个标准品（均购自TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD. TOKYO , JAPAN.TCI）模拟进行体外实验，均不溶于水，二甲基亚砜溶解后配置成不同浓度的溶液备用。3.1.2 MSCs的分离培养 将大鼠股骨、胫骨骨髓用L-DMEM冲出，充分混匀，转入离心管，300g离心10min，去上清，D-Hanks重悬，离心去上清后，加4ml D-Hanks混匀。Percoll分离液按0.56：0.44混合，取4ml放入10ml离心管内，吸骨髓液在离液面2cm处贴管壁缓缓加入。水平离心机900g离心30min，收集单核细胞层，用DMEM洗涤两次。然后计数细胞，调整密度，按1?106/cm2密度接种，37℃，5%饱和湿度的CO2 孵箱培养，培养液为含10?S的L-DMEM，3天后更换培养液，弃去未贴壁细胞，2-3天换液1次，接近融合的MSCs用含0.25%胰酶室温消化2-3min，按1?104/cm2传代，传至第3代得到1?107/cm2个细胞。3.3.3 MSCs的成骨诱导培养 条件培养基（Osteo-induced）和龟板提取物分别作用于第3代MSCs，对照组（Control）不加任何处理因素。Control组培养液为含10?S、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的L-DMEM；Osteo-induced组在Control组基础上加入50μg/ml维生素C＋10mmol/Lβ-甘油磷酸钠＋10-8mol/L地塞米松；S1、S2、S3组在Control组基础上分别加入龟板提取物30mg/ml；各组以1?105/cm2细胞密度接种入预先放置玻片的24孔培养板，待细胞贴壁后，按组加入处理因素，复孔，每3天换液1次。7天后行成骨标记物ALP、OPN的免疫组织化学染色及原位杂交。另以1?105/cm2细胞密度接种入6孔培养板，待细胞贴壁后，按组加入处理因素，复孔，每3天换液1次。7天后提取细胞蛋白行成骨标记物ALP、OPN的Western blot检测。 3.3.4原位杂交检测VDR 24孔板培养3天后细胞爬片，4%多聚甲醛（含DEPC）固定30min,新鲜配置3%过氧化氢-甲醇溶液避光10min, 3%的枸橼酸1ml 胃蛋白酶2滴消化10min,预杂交液38℃于20%的甘油湿盒内孵育3h，杂交液38℃孵育过夜；生物素化羊抗地高辛37℃孵育1h，SABC-POD37℃孵育30min,生物素化过氧化物酶37℃孵育30min。DAB显色约10min，时间可根据显色情况掌握。水洗，脱水封片。阴性对照分别用不含探针的杂交缓冲液取代含探针的杂交液，及用正常羊血清取代羊抗地高辛抗体IgG进行孵育。每组2张玻片，2次独立实验。每张片随机选取5个不重复的200倍视野，计算阳性细胞百分比（阳性细胞百分比=阳性细胞数/总细胞数），并与Control组及Osteo-induced组进行比较。3.3.5 免疫组织化学染色 24孔板处理7天后终止培养，取出盖玻片，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，3%过氧化氢封闭5-10min，滴加羊血清，室温封闭30min弃去，分别加入（稀释度1：400）一抗工作液（ALP、OPN），4℃过夜，0.01M PH 7.2的PBS洗涤液洗涤，再加二抗，即生物素化羊抗兔IgG（稀释度1：500）室温下孵育30 min，DBA显色，苏木素复染，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，实验对照用未诱导的细胞爬片进行染色。光镜下观察、拍照，判定各组ALP、OPN染色的阳性结果（阳性细胞被染成棕黄色）。每组2张玻片，2次独立实验。每张片随机选取5个不重复的200倍视野，计算阳性细胞百分比（阳性细胞百分比=阳性细胞数/总细胞数），并与Control组及Osteo-induced组进行比较。3.3.6 Western blot 法检测 6孔板处理7天后终止培养，称重，按其重量加入适量蛋白裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制剂（PMSF），高速低温离心（12000?10min），提取细胞蛋白。取蛋白样品20μl，加20μl（2?buffer）上样缓冲液，100℃煮3min，离心5min，各取20μl上样，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶5%，分离胶10%，于80-100V进行电泳80min。完整将分离胶取下，于转移缓冲液静置30min后，转移夹靠PVDF膜，排除气泡，以31mA转移60min。取出PVDF膜，TTBS洗5min3次，5%脱脂牛奶封闭30 min，加兔抗大鼠的多克隆抗体ALP、OPN（1：500稀释），即一抗，4℃过液，次日用TTBS洗PVDF膜3次，然后加1：5000二抗（羊抗兔IgG-HRP），室温反应1h。用TTBS洗10min 3次，加超敏发光液反应5min，排去液体，用保鲜膜包裹，用X光片在增感屏中紧密接触，使X光片感光10min，显影，定影，冲洗，晾干，用Uniscan A686扫描系统将条带扫描入电脑。每组2张片，2次独立实验。3.3.7 RT-PCR检测VDR 提取空白组、成骨诱导组、龟板组三组的基因组，总RNA按照Trizol试剂盒说明书进行；RT-PCR参照Genbank的cDNA序列，采用Primer Premier5.0软件设计引物，由上海英骏公司合成。VDR上游引物：5-GGAACGTGCCCCGAATCTGC-3，下游引物：3-CACCCCCATCTCCACGAACTG-5，反应条件为：93℃ 2 min，然后93℃ 45seconds，63℃ 30secends，共30个循环。反应结束后，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。VDR和GAPDH反应条件相同。RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以图像分析仪进行吸光度扫描。3.3.8 统计学分析 实验数据均以（X?S）表示。应用SPSS13.0医用统计软件包进行数据统计学处理，组间比较用单因素方差分析，以P

作品专业信息

撰写目的和基本思路

以“肾主发育，主骨生髓”的为理论依据，本研究运用组织化学、免疫组化、Western blot、原位杂交、RT-PCR等技术，探讨龟板提取物诱导MSCs成骨分化的VDR机制；进一步用分子对接模拟龟板提取物中三个甾类成分（4-甾酮、十四酸甾醇酯、甾醇）对核受体VDR的亲和力，并从实验科学的角度阐明龟板中何种甾类成分是诱导MSCs成骨分化的物质基础，并分析其成骨分化的Shh/Wnt3a信号通路机制。

科学性、先进性及独特之处

1、以“肾主发育，主骨生髓”为依据，立足前期对龟板及信号通路的研究，选题起点高，具有科学性及独特之处。2、循交叉学科，将分子对接引入到中医药研究中，计算机模拟与实验科学相结合，使研究结果真实可靠，具有先进性。3、采用活性导向的标准组分模式，揭示了龟板诱导MSCs成骨分化的Shh/Wnt3a信号通路机制。4、证实4-甾酮是MSCs成骨分化活性物质基础，为创新中药的研究设计提供一条新思路。

应用价值和现实意义

1、从干细胞信号分子的角度阐明“肾主发育，主骨生髓”的机理，提出维生素D受体、Shh信号通路有望成为相关骨疾病的治疗靶点。2、将计算机模拟与实验科学有机结合，发现一个具有成骨生物活性的甾体，为创新中药的研究提供新的思路。具有开拓性，可为同行研究提供参考。3、揭示龟板诱导成骨分化的活性物质基础，为临床应用提供实验依据，具有的突出中医药理论特色。

学术论文摘要

以中医学“肾主发育，主骨生髓”为理论依据，本研究采用细胞形态学、分子生物学等方法检测ALP、OPN及VDR的表达，证实维生素D受体是龟板提取物诱导MSCs成骨分化的可能药理靶点；用分子对接的方法模拟龟板中三个甾类成分与VDR的亲和力，结果表明，4-甾酮对核受体VDR的亲和力较后两者大；采用活性导向的标准组分模式来验证龟板中何种甾类成分是诱导MSCs成骨分化的物质基础，并探讨其信号通路机制。实验结果表明，龟板活性成分4-甾酮能显著增加其钙化结节的数目，提高ALP、OPN、OCN的表达水平，并且以剂量依赖的方式促进Shh 及Wnt3a的表达，表明4-甾酮是龟板提取物诱导MSCs成骨分化的物质基础，其成骨分化的机制可能与上调信号分子Shh 及Wnt3a的表达有关。Cyclopamine阻断Shh信号通路后，Gli1及Wnt3a的表达明显下降，而VDR的表达组间未见明显改变，推测其成骨分化的可能机制与龟板活性小分子直接进入细胞膜作用核受体VDR，进而上调Shh的表达,激活其下游转录因子Gli1及Wnt3a，最终启动成骨分化有关。

获奖情况

1、龟板提取物诱导骨髓间充质干细胞成骨分化和维生素D受体的表达——中草药（已投稿）2、龟板活性成分4-甾酮上调Shh及Wnt3a信号诱导骨髓间充质干细胞成骨分化——中国骨质疏松杂志（已投稿）

鉴定结果

无

参考文献

现有技术：1、本研究龟板有效成分的提取、质量控制科学严谨，其促增值活性已获得一项中药发明专利（专利号：ZL 2006- 10034579.9）、一项学校科技成果特等奖，一项广东省科技成果三等奖。2、徐筱杰教授小组开发的中药有效成分三维结构数据库、中国科学院上海药物所开发的中国天然产物数据库以及中国科学院工程过程研究所开发的中药化学数据库。技术文献：[1] D.-F. Chen, H.-P. Zeng, S.-H. Du,et al.Extracts from Plastrum Testudinis promotes proliferation of rat bone-marrow derived mesenchymal stem cells[J].Cell Proliferation, 2007, 40, 196-212, SCI，IF=4.5.[2] 陈薇，曾和平，王春燕，等.中药龟板提取物化学成分及其调控鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)增殖活性的实验研究[J].化学学报, 2007, 65(3):265-270. SCI，IF=0.85.[3] He-Ping Zeng, Ting-Ting Wang, Xin-Hua Ouyang, et al. 8-Hydroxyquinoline derivatives induce theproliferationof rat mesenchymal stem cells (rMSCs)[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006, 14: 5446-5450. SCI，IF=2.2.[4] D. F. CHEN, J. H. ZHOU, H. LI,et al. Effects of traditional Chinese drug on proliferation of rat mesenchymal stem cell in vitro[J]. The FEBS Journal.2005; 272(suppl.1): 141.SCI，IF=3.2.[5] 朱伟， 陈可冀，徐筱杰.计算机药物虚拟筛选技术在中医药领域中的应用前景.中国中西医结合杂志，2007，27（3）：263-266.

同类课题研究水平概述

1、骨髓间充质干细胞定向成骨分化 MSCs的数量和功能是维持正常骨稳态的决定性因素。因此，维持MSCs的成骨分化潜能具有现实的意义。目前诱导MSCs成骨分化大致有两种：一是不同细胞因子诱导MSCs成骨分化，但细胞因子（如BMP、TGF-β、bFGF）的获得，方法繁琐、收获量少、纯度低，在体内极易被降解破坏，难以满足研究和临床应用。二是中药活性成分诱导MSCs成骨分化。中药的活性成分是中药治疗与预防疾病的物质基础，国内学者提取中药有效成分（大黄素、淫羊藿总黄酮、金雀异黄酮）观察它们对于MSCs成骨分化的影响。总体来看，他们的研究为中药的现代化指明了方向，不可否认的是，他们并没有更为深入地探讨中药发挥药效的物质基础及靶信号、靶蛋白。2、VDR、Shh及Wnt3a与骨代谢 Shh蛋白能够直接影响多潜能的前体细胞（如：C3H10T1/2、C2C12、2T3细胞）向成骨细胞分化，或者直接作用BMPs家族成员，再作用干细胞，最终提高成骨分化早期标志物ALP的活性表达。Wnts蛋白是调控间充质细胞特性的关键因素，通过控制成骨细胞分化、增殖、凋亡从而多层次调控成骨细胞生理及出生后骨量的获得。Wnt3a作为Wnts家族的成员，亦是调控间充质细胞特性的关键因素，可影响多潜能的前体细胞向成骨细胞分化的过程。有文献指出，Wnt3a是Shh的下游，Shh诱导的成骨分化至少有部分是通过Wnt3a介导的。VDR是介导1，25 (OH)-D3发挥生物效应的核内生物大分子，它在维持机体钙、磷代谢，调节细胞增殖与分化等方面起重要作用。通过研究VDR基因敲除小鼠发现，VitD的大多数生物学作用是通过VDR介导的，VDR缺陷可引起多种疾病的发生。3、计算机辅助药物设计在中医药领域的应用 分子对接法是一种基于受体大分子三维结构来寻找先导化合物的重要方法。对接计算时，将配体分子放到受体活性位点，然后按照几何互补、能量互补以及化学环境互补的原则来实时评价配体与受体相互作用的好坏。国内外运用该系统进行辅助药物设计，取得了一定的成果。徐筱杰等将计算机药物虚拟筛选技术应用于中医药领域的研究，初步建立了中草药有效成分三维结构数据库和北京大学药物设计系统的两个数据库。陈凯先等、Judith等以受体为靶点，进行了较为大规模的药物筛选，取得了已经的影响。但普及程度不高、交叉应用较少。