苹果多酚氧化酶的提取及其抑制作用的研究2
《现代食品科技》 Modern Food Science and Technology Vol.22 No.4(总90)
文章篇号:1007-2764(2006)04-0082-025
苹果多酚氧化酶的提取及其抑制作用的研究
刘文山，肖凯军，郭祀远
(华南理工大学食品学院，广东广州 510640)
摘要：以冷冻丙酮制备苹果多酚氧化酶(PPO), 通过以邻苯二酚为底物测定氧化产物的方法，对苹果果肉中多酚氧化酶的pH值、温度、热稳定性及抗氧化剂抑制作用进行了研究。结果表明：用真空冷冻干燥得到的酶粉能更好的保持多酚氧化酶活性；酶氧化邻苯二酚的最适pH为6.0，最适温度为25℃；PPO在20-25℃时对热较稳定，期后随着温度升高后，酶活迅速降低；在100℃维持1min酶全部失活；抗坏血酸和黄酮类物质能明显地抑制酶促褐变。
关键词：苹果多酚氧化酶；酶促褐变；抑制；抗坏血酸；黄酮
The Extraction and Inhibition of Apple Polyphenol Oxidase
Liu Wen-shan, Xiao Kai-jun, Guo Si-yuan
(college of Light Chemistry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou510641,China)
Abstract: Apple polyphenol oxidase(PPO) was extracted with cold acetone and treated with freezing dry. The characteristics of PPO were investigated by determining oxidative product using catechol as substrate. The results showed that vacuum freeze drying for enzyme preparation was better to keep the activity of PPO. The optimal reactive temperature and pH value of PPO were 25℃ and 5.0. It was also found that PPO was stable in the range of from20℃ to 25℃. Further increase in temperature, however, decreased its activity. Heated at 100℃ for 60 s, the activity of PPO was almost lost. Ascorbic acid and flavone could significantly inhibit the browning reaction catalyzed by the PPO. The enzymatic activity decreased with the increase of storage time at 25℃ and 4℃, and the activity can keep higher at relatively lower temperature.
Keywords: Apple polyphenol oxidase; Enzymatic browning; Ascorbic acid; Flavone
与其他果蔬相比，苹果在加工中的酶促褐变尤为严重，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，简称PPO)参与苹果的酶促褐变早已得到证实，人们一直在寻找合适的、能用于抑制苹果多酚氧化酶的活性的防褐变剂，以此来生产出高质量的浑浊苹果汁。亚硫酸盐是有效的防褐变剂，但它会造成硫的残余而影响人们的健康，美国FDA已于1986年限制了它在果蔬中的使用。抗坏血酸也是较早使用的防褐变剂，但它的抗褐变效果有浓度依赖性，添加量少效果较差，添加量过多会在果汁存放过程中因非酶促氧化降解而使果汁颜色变暗。 据报道，黄酮具有抗氧化性[1]，它用作苹果的的抗褐变剂几乎没有报道。本文对苹果多酚氧化酶特性加以研究，旨在考察可用于食品的防褐变剂黄酮对其的影响及其与抗坏血酸防褐变能力的比较，为在苹果加工过程中避免或减轻褐变的产生，生产品质上乘的产品提供一种途径。
收稿日期：2006-04-25
广东省科技公关项目(编号:2004B10201001)、广州市科技成果推广项目（编号：2006C13G0011） 作者简介：刘文山，在读硕士
1 材料与方法
1.1 材料
选用优质红富士苹果 1.2 仪器
ALPHA2-4 真空冷冻干燥机：博砺行仪器有限公司；尤尼柯紫外可见分光光度计UV-2102：尤尼柯上海仪器有限公司；PHS-3C型酸度计：上海虹益仪器厂；家庭用果汁捣碎机；TG16-WS台式高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。 1.3 方法
1.3.1 PPO的提取
苹果洗净后在4℃保温，再去皮后取果肉200 g，立即加人冷冻丙酮(-20℃)500 m1，用高速组织捣碎机匀浆2min；用布氏漏斗抽滤，滤饼用200 ml冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末冷冻真空干燥，即得PPO丙酮粉。
称取丙酮粉0.5 g，溶于250m1 0.05mol/L．pH 6.8的预冷(4℃)磷酸盐缓冲溶液，用磁力搅拌器搅拌20min，5000 r/min离心10min，上清液过滤，即得苹果PPO粗酶液。
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《现代食品科技》 Modern Food Science and Technology
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1.3.2 多酚氧化酶测定方法
在1 ml磷酸氢二钾一柠檬酸缓冲液中，用1 ml 0.1 mol/L的邻苯二酚为底物，加1ml酶提取液，反应3 min后，在分光光度仪上扫描并观察300-450 nm波长范围内的吸收峰情况。测定时以水为空白，以热失活的粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照。 1.3.3 PPO活性的测定
取磷酸盐缓冲溶液1 ml于1 cm比色皿中，加人0.1 mol/L邻苯二酚溶液1ml。混匀后在400mm处比色，酶液加人后开始记时，每15s记录一次OD随时间的变化值，以最初直线段的斜率△OD／t)表示酶活力，一个酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.001所需的酶量。 1.3.4 pH对PPO活性的影响
配制0.2mol/L柠檬酸缓冲溶液(pH 3.5~5.6)，0.2mol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(pH 5.0～8 0)。
在1cm比色皿中，加人试验所设定的缓冲溶液1ml，0.1mol/L 邻苯二酚溶液1 ml，PPO粗酶液0.4 ml，混匀，在室温下测定PPO的活性。 1.3.5 温度对PPO活性的影响
在1cm比色皿中，加人0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0) 1 ml，0.1 M邻苯二酚溶液1 ml，在某一温度(10-55℃)下保温5min，加人相同温度下保温5 min,粗酶液1.6ml，迅速测定PPO的活性。 1.3.6 PPO的热稳定性
PPO粗酶液在100℃水浴处理一定时间后立即置于水浴中，然后在反应体系pH6.0室温下测定PPO的活性。
1.3.7 抑制剂对PPO活性的影响
用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)，配制不同浓度的黄酮化合物和抗坏血酸抑制剂溶液，在反应体系pH 6.0、室温下测定PPO的活性。 2 结果与讨论
2.1 多酚氧化酶活性的表示
苹果多酚氧化酶的催化氧化邻苯二酚的产物，在400 nm处有一最大吸收峰。多酚氧化酶的酶反应进程曲线(图1)测定表明，在测定时间为1 min时，产物的生成速度和酶量具有较好的线性关系.所以本文除特殊说明外，用测定产物在1 min内400 nm处吸光值的变化来反映多酚氧化酶的活性。
从图1可以看出，苹果内的多酚氧化酶氧化邻苯二酚的反应和产物的初始生成速度较快，但多酚氧化酶很快就表现出失活，这是因为生成的醌使多酚氧化
酶受到抑制的结果，前人[23]曾报道过这一现象。
图1 酶反应进程曲线
2.2 酶活测定所用缓冲溶液pH值的测定
鉴于不同种类，甚至同一种果蔬中的不同品种得到的PPO具有不同的最适pH值[3]，此外，报道的测定PPO活力时所用的pH值有4.5、5.0、6.0和6.5[4,5,6]，故有必要探讨富士苹果PPO的酶活测定所用缓冲液的pH值。
苹果多酚氧化酶对pH的变化相当敏感。如图2，当pH值在6.0附近时，表现最高活力，当pH升到
8.0时，其活力只有最高活力的19%;当pH降到3.5附近时，其活力仅为最高活力的25%; pH值越低，酶活下降越甚。
图2 酶活与缓冲液pH值的关系
2.3 温度对PPO活性的影响
采用调节温度来控制酶催化反应速度是非常重要的。一方面，在低温下保藏食品能减少酶对软化、不良风味的产生和成熟等的影响；另一方面，在食品加工中采用高温处理能破坏或钝化所有的酶活力。此外，在酶测定中准确地控制温度是得到可靠重复数据的先
［］
决条件7。温度对多酚氧化酶的影响是双重的，一方面温度升高能加快酶催化反应速度进程，另一方面促使酶蛋白变性，是2种对抗效应综合反应。图3为粗酶液在不同温度下处理5min后的效果图，由图可知，苹果中PPO的最适温度为25℃。当温度降至10℃，酶活性为最高活性的77％；当温度升至55℃，酶活力性为最高活性的59.6％；因此，调节温度条件能有效抑制酶的
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活性。
时，于24h内，则没有发现多酚氧化酶被抑制后又恢复活性的现象。Krueger[9]曾报道抗坏血酸能促进多酚氧化酶的活性，但却能阻止其接触氧化邻苯二酚时的变褐作用，因为抗坏血酸在多酚氧化酶接触氧化邻苯二酚的反应系统中，能防止邻苯醒的进一步氧化，瞬时地将邻苯醒还原为邻苯二酚。
图3 不同温度对PPO
活性的影响
图6 黄酮对酶活的影响
图4 热处理时间对PPO相对活性的影响
由图4可知，苹果多酚氧化酶在100℃下仅处理10s,酶仍保留大部分活性;而且，当处理40s时,酶才基本失活，直至60s时才完全失活。可见苹果内的多酚氧化酶的热稳定性显然不同于类似于漆酶的荔枝果皮多酚氧化酶[8]，荔枝果皮的多酚氧化酶经煮沸5 min后仍能保持其部分活性。 2.4 抑制剂对酶活的影响
如图6所示，当黄酮类化合物的浓度高于66 ppm时，它能很好地抑制多酚氧化酶的活性，可见黄酮类化合物是一类较好的抗氧化活性的物质,这是由于黄酮类化合物中含有酚羟基,能与金属发生螯合,也能清除活性氧,终止自由基连锁反应,阻止单线态氧(1Ｏ2)的形成[10]。因此,板栗壳色素具有抗氧化性,很可能是其中含有黄酮类物质的结果。 3 小结
（1）多酚氧化酶的最适pH值为6.0，在pH值5.5-6.0范围内酶活力最大；其他pH值下均表现出不同程度的抑制，因此可通过调节pH值来控制苹果褐变的程度。
（2）多酚氧化酶对热敏感，其最适温度为25℃，100℃处理1min酶基本全部钝化。
（3）黄酮与抗坏血酸防止酶促褐变有明显作用，防褐变力相当。 参考文献
[1] [2] [3] [4] [5]
孔琪.菊花黄酮的提取及抗氧化活性研究[J].中草药，2004,35（9）:1001-1002.
Alfred MM, Harel E. Polyphenol oxidase in plants. Phyto- chemistry, 1979,18(2):193-215
王璋.食品酶学[M].北京:中国轻工业出版社,199l：263. B K Tan,N D Harris. Maillard reaction products inhibit apple polyphenoloxidase. Food Chemistry[J],1995,53: 267 于佳.富士苹果多酚氧化酶特性研究[J].中国野生植物资源,1998,18(4)：13-16
(下转第155页)
图5 抗坏血酸对酶活的影响
如图5，抗坏血酸对多酚氧化酶催化氧化酚类化合物的变褐反应表现出明显的抑制作用，并且这种抑制作用随着抗坏血酸浓度的提高而加强。但是，在一定浓度下(33ppm)，它对多酚氧化酶的抑制只能维持一定时间，当反应体系中抗坏血酸被全部氧化后,酶促反应速度随即又恢复正常水平;而在浓度高于330 ppm
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2.3 氨基酸分析
氨基酸（AA）是组成蛋白质的基本单元，蛋白质经酸、碱或蛋白酶水解后生成游离氨基酸，随着现代科学的发展，氨基酸的重要性日益突出，用途也愈来愈广泛的被了解。如赖氨酸可改善营养不良、蛋白质代谢障碍等症状、促进生长发育、促进食欲、增补营养、增进年老弱者的身体健康，并具有促进病后机体恢复等特殊功效；甘氨酸对细菌有专一的抑制作用；天冬氨酸具有抗疲劳作用；L-组氨酸可治疗胃和十二指肠溃疡及肝炎等；L-精氨酸用于治疗肝昏迷等症；谷氨酸有益于肝脏、消化系统和脑神经代谢[8]。
取一定量样品，加入适量6mol/lHCl，封口，置110℃恒温箱中水解24h，用氨基酸自动分析仪测定，检出15种氨基酸，其中含有7种人体必需氨基酸，结果见表6。
表6 鹿胎衣蛋白中氨基酸的组成 单位:mg/g 名称 天冬氨酸(Asp) 谷氨酸(Glu) 丝氨酸(Ser) 组氨酸(His) 甘氨酸(Gly) 苏氨酸(Thr) 精氨酸(Arg) 丙氨酸(Ala)
含量
名称
含量
3.2 营养成分测定结果为：蛋白含量77%，脂肪含量7.8%，糖含量3.4%。
3.3 本实验提取分离的鹿胎衣蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法初步证实了鹿胎衣水溶蛋白是由5种分子量分别在14KD-32KD之间的蛋白质组成的混合物。
3.4 氨基酸分析表明，鹿胎衣蛋白质含有15种检出氨基酸，其中含有7种人体必需氨基酸。
3.5 鹿胎衣是迄今为止尚未被利用起来的高蛋白物质，因此，充分利用现代生物技术，开发研究鹿胎衣产品具有良好的经济价值，本实验将为下一步鹿胎衣蛋白的提纯及其活性研究奠定基础。 参考文献
[1] 倪佳奎.药用鹿产品的临床应用与概述.吉林中医药,1986,
(3): 33-34.
[2] 隽兆东,管英俊,郭继志. 对羊膜认识过程的哲学启示. 医
33.59 18.67 赖氨酸(Lys) 学与哲学,1999,20(3):53-54. 60.00 22.88 胱氨酸(Cys) [3] 周爱儒，查锡良.生物化学第6版.北京：人民卫生出版社，13.26 21.44 缬氨酸(Val)
2004：160.
18.84 14.74 蛋氨酸(Met)
[4] R.V.Muralidhar,T.Panda.Value based products from human
45.58 38.81 苯丙氨酸(Phe)
placeta Bioprocess Enineering.2000,22:145-148 38.46 17.19 异亮氨酸(Ile)
[5] Michel D.et al. Colorimetric method for determination of 30.88 3.789 亮氨酸(Leu)
11.58 sugars and related substance.Anal.Chem.，1956.28：350-357
[6] Laenm Liu K.Cleavage of Structural Proteins during the
Assembly of Head of Bacteriophage.T4.
Nature
3 结论
(Landon),1970,227:680-685. 3.1 本实验以新鲜鹿胎衣为原料，经过初处理，采用
[7] 滕利荣.生物学基础实验教程.长春：吉林科学技术出版社, （NH4）2SO4盐析沉淀法提取水溶性蛋白，并通过正
1999: 503-505. 交实验确定了蛋白质提取分离的优化条件：盐析时间
[8] 村上元孝.老年病学.人民卫生出版社，1981：67-69 为12h、盐析pH值为7、（NH4） 2SO4饱和度为60%。
(上接第84页) [6]
E Palou, A Lopez-Malo, et a1. Polyphenoloxidase activity and color of blanched and hydrostatic pressure treated banana puree[J]. J Food Science, 1999,64(1)：42-45.
[7]
Thomas P, Nair PM. Effect of gamma irradiation on polyphenol oxidase activity and its relation to skin browing in banana. Phytochemistry, 1971,10(3):771-777.
[8] [9] [10]
李明启,严君灵.荔枝果皮多酚氧化酶的研究[J].植物学报,1963,11(4):329-336.
Krueger RC. The role of reducing agents in the action of tyrosinase. Arch Biochem Biophysio,1958, 76(1):87-96. 汪秋安.天然黄酮类化合物的生理功能及其应用[J].香料香精化妆品,1999(1):28-33.
[15] [14] [13]
[11] E Palou, A Lopez-Malo, G V Barbosa-Canovas, et a1.
Polyphenoloxidase activity and color of blanched and hydrostatic pressure treated banana puree[J]. J Food Science, 1999,64(1)：42-45.
[12] Thomas P, Nair PM. Effect of gamma irradiation on
polyphenol oxidase activity and its relation to skin browing in banana. Phytochemistry, 1971,10(3):771-777.
李明启,严君灵.荔枝果皮多酚氧化酶的研究[J].植物学报,1963,11(4):329-336.
Krueger RC. The role of reducing agents in the action of tyrosinase. Arch Biochem Biophysio,1958, 76(1):87-96. 汪秋安.天然黄酮类化合物的生理功能及其应用[J].香料香精化妆品,1999(1):28-33.
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