胱抑素C的生物学特性及临床应用评价
胱抑素C(cystatin C,Cys-C)是一种小分子碱性分泌性非糖化蛋白质,最初被认为是脑脊液内的γ-痕量球蛋白(γ-trace protein)。1981年测出了人类Cys-C的单链氨基酸序列,这是胱氨酸蛋白酶抑制蛋白质超家族中测定出的第一个蛋白质序列,其顺序与任何其他蛋白质无显著的同源性。人类的Cys-C的氨基酸序列与哺乳动物有很强的同源性,被看作是半胱氨酸蛋白酶的抑制剂。此后的二十年中又进一步发现了11种同属于胱蛋白酶抑制剂的超家族成员,至此,人类胱蛋白酶抑制剂家族共由12种蛋白质组成(见表1)。
在胱蛋白酶抑制剂家族中Cys-C是很独特的,它产生于人体所有的有核细胞。使用免疫化学法和RNA印迹法研究人体组织和细胞系发现,在所研究的细胞中都存在Cys-C或其mRNA。同样,对培养的人细胞系进行Cys-C产物分析显示,所有被研究的细胞系也都分泌Cys-C。Cys-C的mRNA表达无明显组织特异性,正常人脑组织和精囊中最高,肾组织中次之。人类Cys-C基因和其启动子结构测定证明了它的管家型基因,即大多数有核细胞通常都可恒定地分泌Cys-C。存在于Cys-C mRNA前端的前导序列充分地证实了这个说法。
Cys-C的物理化学特性
通过单链氨基酸序列测定计算,Cys-C相对分子质量约为13 343,含120个氨基酸残基,位于人类第20号染色体。约50%的Cys-C在3′位携带一个羟化的脯氨酸残基,羟化了的Cys-C的相对分子质量为13359。Cys-C的结构已经清楚,它的典型特征是含有1条α1螺旋穿跨链的5′端反向平行的β折叠片段。Cys-C和鸡的Cystatin均为椭圆型,pH值为8.6,等电点为9.3,在体液中带正电荷。表2列出了它的理化特性,表3给出了不同体液中的Cys-C的浓度。
Cys-C作为肾小球滤过率(GFR)标记物的生理特征及诊断价值
Cys-C是小分子蛋白,正常状态下可以自由通过肾小球滤过膜,所以长期以来一直作为肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)的标志物。肾功能正常时,这些小分子蛋白几乎全部被重吸收,在近端小管处降解。大鼠Cys-C降解研究表明,它的肾脏血浆清除率是51Cr-EDTA的94%,至少99%滤过的Cys-C被肾小管细胞降解。通过结扎一组鼠的肾动脉丛上方的主动脉使它们的GFR不同程度地减低,此时Cys-C与51Cr-EDTA肾脏血浆清除率有良好的相关性,回归相关系数为0.99。此项研究还清楚地说明了小管的周围组织对Cys-C有不显著摄取。免疫化学及RNA印迹法研究也有力地证实Cys-C在通过肾小球滤过膜后由近端小管细胞降解。由于Cys-C这些特征,加上其在体液中稳定的含量,足以认为Cys-C是GFR的理想标志物。在早期的人群调查中也证明Cys-C确实是优于血清肌酐、GFR的良好标志物,且要好于β2-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、补体因子D等其他低分子量蛋白。
证实Cys-C在体液中含量的稳定很重要,迄今为止,生理情况下几乎没有影响Cys-C稳定的因素。对患者群体的大样本研究表明,除了受肾小球滤过率的影响,Cys-C的血清水平与任何生理状态均不相关,因为其他大多数组织仍可稳定地分泌Cys-C。大剂量的糖皮质激素可使其分泌量增加,而小剂量及中等剂量的激素不会影响到它的产量。甲状腺功能障碍对Cys-C水平的影响较为明显,即使是轻度的甲状腺功能障碍对其影响也是很大的。因此,当它作为肾功能的指标时一定要同时考虑甲状腺的功能状态。可以肌酐的浓度作为参照,当甲低时,Cys-C的水平就降低,而当甲亢时,其水平就升高。
由于Cys-C与身高、年龄、性别、机体成分及急性时期反应均无关,其血清浓度主要取决于肾脏功能,这一特点使得Cys-C成为引人注目的GFR的替代标志物。许多试验采用Bland-Altman法研究Cys-C与GFR的金标法的一致性,多数未发现系统偏差,但外源性清除试验和通过血清Cys-C计算所得的GFR之间存在较大的离散度(±40%,±2s偏差)。总之,Cys-C作为GFR的替代标志物要优于校正的肌酐值。但Cys-C也有局限性,其个体差异较大,研究发现Cys-C的个体差异与肌酐非常相似。
最近,在成人和儿童中有46项研究采用血清肌酐对照方法分析了Cys-C的诊断性能。汇总3 703例数据分析,比较GFR与血清肌酐和Cys-C之间倒数的相关系数发现,Cys-C有更好的相关性。在一个997例的小样本得到的ROC曲线下,显示了一个非常显著的良好区域(平均值r=0.926,95%的可信区间是0.892～0.960;平均值r=0.837,95%的可信区间是0.796～0.878)。这些数据表明,GFR减弱时检测Cys-C比血肌酐要好的多,在具有代表性的研究中更是如此。
Cys-C的临床应用
Cys-C测定所适合的患者:一是那些肌肉量减少或变化较大的人群,如老人和小孩;另一个目标群体是那些GFR临界危急而需要准确判断的患者,如接受肾移植的患者,这些群体正是目前研究所关注的对象,也是目前许多研究都集中在这类群体的目的所在。
GFR测定的金标准如菊粉清除率试验,有许多缺点,且有危害性,尤其对儿童不适合。目前评价GFR最常用的实验室参数是血清肌酐。在儿童和青少年,以血清肌酐作为GFR理想标志物的局限性已被认同。肌酐的含量与肌肉有关,随着成长和青春期的到来其肌肉量不断增长,男孩尤其显著。因此,青春期后的肌酐参考范围要根据性别进行调整。由于儿童的肌肉和肌酐生理值低,则任何由肾小管分泌或非肾性清除所造成的误差都会严重影响实验结果的正确评价,尤其是临床医生不熟悉肌酐的生理状态,未能意识到肾脏机能障碍的现象仍较为普遍。对于这些局限性临床上采用了一些校正公式,如在不同身高/肌酐比值的水平上采用GFR指标进行评价,以常数K反映身体情况,不同性别、不同年龄组的K值不同。但这些公式不适用于身体组成发生变化或肌肉大量减少的患者,如脊柱裂、神经肌肉性疾病、神经性厌食和肝硬化的患者。
Cys-C与肌酐不同,Cys-C血清浓度从1～50岁均保持恒定。理论上,肾脏生理功能1岁时已基本成熟,Cys-C在刚出生时可高达2.8mg/L,而出生后迅速下降,提示肾脏功能已成熟。Cys-C与血肌酐不同,它不经胎盘转移,因此Cys-C可用于评价新生儿甚至胎儿在产前及产后的GFR。另外Cys-C与妊娠期无关,因而有助于早产儿的检测。
为评价Cys-C作为替代标志物的应用可行性,进行了一些肾小球滤过率与替代标志物倒数的相关性实验研究,除1例外,Cys-C的倒数与检验GFR金标准的相关性均高于血肌酐。作为GFR的标志物,Cys-C与机体组成无关。血肌酐测定的应用有许多局限性,在儿童和老龄人群尤其是一些肌肉缺乏的患者,这种局限性非常明显。虽然采用校正肌酐值可克服上述问题来评价肾病,但Cys-C应该是发现早期肾损伤的更好的标志物。最新研究表明,对那些患有脊柱裂、脊髓损伤其肌酐检测值已相当不准确的患者,Cys-C是唯一可靠的GFR标志。
妊娠中的Cys-C:妊娠期的肾功能评价具有挑战性。众所周知,测定菊粉清除率来评价GFR时,由于肾功第二储备增强,妊娠早期清除率是增加的。在门诊,妊娠的第三个季度肌酐清除率实际上趋于下降,另一些研究表明,这种超常的肌酐清除率伴随着整个妊娠后期。对妊娠期Cys-C的研究较少,Cataldi等发现妊娠期妇女的Cys-C水平高于正常人参考值。对于先兆子痫,其主要的病理改变是肾功能变化,早期诊断非常重要。Strevens和Wide-Swensson采用受试者工作特性曲线研究了Cys-C分析数据,表明与肌酐相比,Cys-C显示了良好的诊断性能。
以碘海醇清除率为标准,同组的Cys-C与GFR之间有相关性,而妊娠与非妊娠妇女则不同。后来又证明在正常的妊娠期间,Cys-C的水平在第6～9个月时是逐渐增高的。这也印证了先前的观察,即与Cys-C相对分子质量相似物质的清除率在妊娠最后的3个月内是下降的,并且意味着在妊娠期间的量是可变的,因而Cys-C可作为内分泌疾病的标志指标,Cys-C对于妊娠期间肾脏疾患的评价方面是否有临床应用价值还需做许多工作。
肾移植患者的Cys-C:肾移植是治疗成人和儿童晚期肾病的最终选择,对于同种异体移植物的急、慢性排斥检测,必须进行密切的移植物功能监测,以及免疫抑制药物的肾毒性检测。实际工作中评价GFR的首选参数是测定血清(浆)的肌酐值,其优点是:成本低、速度快、自身干扰小、并有临床应用经验可借鉴(特别是肾脏专家)。临床上很少使用Cys-C作为肾移植患者的备选指标,自从1998年首次报告以来,许多临床的论文议题开始专注于使用Cys-C作为肾移植的指标,据报道与血清肌酐相比,肾移植患者不同的个体Cys-C的水平变异很大,对将其作为个体的备选指标提出了质疑。另有两项局限于儿童手术后情况的研究,对Cys-C的个体变化与肌酐之间的不同没有确定。在对肾移植患者术后稳定期的严格的对比试验中(参见GFR的金标准参考值与Cys-C的对比),Cys-C与GFR的相关性优于肌酐:r=0.879和r=0.784。至今例数最多的研究(110例患者)证明,在所有的肾移植物的功能检测中,血清Cys-C能准确地反映肌酐的清除率,监测肾移植患者肌酐清除率的减少,血Cys-C与血肌酐同样有效。
尚有许多悬而未决问题,如术后Cys-C比肌酐下降得快,尤其外科手术后4d内的变化反复不稳定。而后,依据肌酐判断的GFR要高于Cys-C所作出的判断,这种状况一直持续到患者出院。Hermida和Bokenkamp等证实了这些现象,然而却不了解其潜在的机制。目前在同种异体移植术后Cys-C动力学的预后价值(如果存在)仍是未知的。
Cys-C的检测方法和成本
目前尚未发现有干扰Cys-C测定的物质,所以可以肯定Cys-C测定结果的可靠性与真实性,随之发展起来的检测方法有单项免疫扩散法、酶免疫法、荧光免疫法、放免法及颗粒增强免疫比浊法。单向免疫扩散法耗时长达10～20h,变异系数高(10%左右);荧光免疫法和放射免疫法因需要昂贵的仪器或具有放射性污染问题难于广泛推广;继而发展起来的颗粒增强免疫比浊法可自动化检测,既快速又准确,使Cys-C检测得以在临床大量使用。
关于成本与实用性,肌酐与Cys-C都可以既快速又简易地检测。肌酐测定成本低,不到Cys-C的十分之一,而51Cr-EDTA或99Tc-DTPA清除率的研究成本大约是Cr的200倍,并且技术较难,可导致放射源暴露,需要半天入院时间。相比之下,Cys-C是可接受的选择。
激素对Cys-C影响的研究尚待深入,如在甲亢或妊娠时,将Cys-C作为血清肌酐的替代实验就需要进一步探讨。急性时相反应和机体成分改变不会对Cys-C的生成产生影响,而药物如皮质甾类、环孢素等其他药物的影响还需进一步的评估。作为适用于透析治疗观察的标志物,Cys-C尚需要进行更多的研究工作。
小结
Cys-C是一个有吸引力的GFR的标志物,其优越性超过了以往使用最广泛的血肌酐。Cys-C对于诊断轻度肾损伤具有更高的敏感性。在一些代表性的研究中证实Cys-C的优越性在于发现GFR的衰减,即使采用肌酐的计算公式(基于高度、年龄、性别等等)也不如Cys-C。Cys-C优点是与身高、性别、年龄及肌肉质量无关,特定人群如儿童、老年人及肌肉质量减少的患者特别适用Cys-C。因此,Cys-C是在特定条件下反映肾脏功能是否正常的有用的筛选工具。妊娠期间以Cys-C作为GFR的标志物,并将其作为子痫前期的早期监测指标也是令人感兴趣的。然而,更值得关注的问题是与血清肌酐值进行纵向比较时,必须标注患者较高的个体差异所引发的不一致。很少有研究分析个体内部的可变性,这种可变性在成人肾移植患者中显得尤为突出。在肾移植中目前仍不清楚在对肾功能的短期及长期的监测中,Cys-C相对于肌酐是否具有显著性的优势,还需要在其他病组中做更充分的工作。
作者：天津中医药大学附属第一医院检验科 蔡钢强 垢敬综述 焦连亭审校