小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
姓名:高超 学号:[1**********]0 班级:2013级生科三班 实验名称:细胞生物学实验 同组者:樊晓航
一,实验目的:
1,了解原代培养的基本方法及操作过程。
2,学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。 3,初步掌握无菌操作方法。
4,学会分辨死活细胞,掌握细胞计数。
二,实验原理:
1,细胞培养:细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织(或器官)取出,模拟动物体内的生理条件,在体内进行培养,使其不断生长、繁殖,人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。细胞培养的突出优点,一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响,二是细胞培养便于人们对细胞内部结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术,但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官,经体外培养后,直到第一次传代为止。这种培养,首先用无菌操作的方法,从动物体内取出所需的组织(或器官),经消化,分散成单个游离的细胞,在人工
培养的条件下,使其不断地生长及繁殖。
要细胞能在体外长期生长,必须满足基本要求:一是供给细胞存活所必须的条件,如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度,注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
2,细胞鉴定与计数:台盘蓝氧化与还原型颜色不同,活细胞由于新陈代谢产生较强还原力,染色后呈无色,死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行,即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上(计菌器),于显微镜下直接观察计数。 三,实验用品:
1,器材:解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、离心管管(上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好,置于无菌操作台)
倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板
2,试剂:
PBS 缓冲溶液、培养液、台盘蓝
3,材料:小白鼠的脾脏细胞
四,实验步骤:
1,细胞的原代培养(悬浮培养):
1.1断头法处死小鼠,将血放掉洗净,在酒精中浸泡3min 消毒。
1.2在超净工作台无菌操作,将小鼠背朝下放在解剖板上,用镊子提起腹部皮肤,剪开。沿开口向两侧斜着剪开,翻起皮肤露出腹
腔,即可看到白色的胃。提起胃,找到后面条状的脾,用弯头镊子取出脾,将周围的脂肪组织去除。PBS 缓冲液清洗1-2次待用。
1.3在无菌培养皿内加入PBS 缓冲液30滴,用L 型针头吸取PBS0.2mL 注入小鼠脾脏,用针头在脾脏上戳几个小孔,顺脾脏轻轻刮,从小孔挤出分散的细胞。
1.4将培养皿倾斜,使大块组织充分沉淀,吸取分散的细胞悬液2mL ,1200r/min离心2min 。
1.5取塑料培养皿一个,用“枪(1mL )”加入细胞培养液2mL ,在盖上加标记后待用。用“枪(200μL )”吸取塑料皿中的培养液400μL ,加入离心后并弃去上清液的离心管管中,用枪头吹散并混匀细胞,然后吸取200μL 接种于上述塑料培养皿中,混匀,放入37℃,5%CO2培养箱中培养。
2,原代细胞观察、死活鉴定及计数
2.1取出培养物,观察培养液的颜色。然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况(见图1)。
2.2取0.5mL 细胞悬浊液于试管中,加1-2滴台盘蓝染液混合均匀,染色2min 。
2.3将上述染色后的细胞液制片,在显微镜下观察,鉴定死活(见图2)
2.4将细胞悬液滴在计数器两边V 字形槽内。细胞悬液依毛细作用扩散到计数区。在镜下计数。取中间和四个角上的中等方格,计数每个方格内死活细胞的数量。(注意: 当遇到位于大格线上的细胞,
一般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。)先计数总细胞,再计数死细胞(蓝色)。计算细胞死亡率。
五,实验结果:
1. 细胞原代培养形态观察
原代培养后的培养皿呈粉红色,未出现异味,未被污染。在倒置相差显微镜下观察可看到聚集生长的细胞,形态不明显。
(图
2)
2,细胞计数:
细胞浓度(个/ml)=5个方格内的细胞总数×5×10000× 稀释倍数 细胞浓度=80×5×1000×1=4000000(个/ml)
活细胞率=44÷80=55%
六,分析与总结:
1、 取小鼠脾时注意保持其完整,注入缓冲液要慢而准且适量,不要撑破脾脏,保证细胞分散游离出来。
2、 培养液PH 为7.0~7.4,其中加有酚酞,正常状况细胞生长过程代谢物使PH 下降,培养液的颜色改变呈黄色,因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况。
生长状况良好的细胞膜和核完整,细胞质透明,而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆形,折光率高,而衰退期细胞皱缩,透明度下降,立体感很差,较易区分。