叶绿素的分离与提取的实验探究
开题报告
叶绿素的分离与提取的实验探究
一、研究背景及意义
现行高中生物新教材的教学内容中增加了大量的实验，这是党和国家推行素质教育，培养学生动手能力、创新能力的重大改革。生物实验课在整个中学阶段的生物教学中占有举足轻重的地位，我们不仅重视常规实验教学的开展，还不断地研究实验方法的改进。如叶绿体中色素的提取和分离实验（高中生物原教材中的实验4，新教材中的实验8），实验的目的是要求学生理解和掌握提取和分离叶绿体中色素的方法，探索叶绿体中有几种色素。它是高中必做实验中难度较大的一个探究性实验，过去做这个实验所需步骤多，时间长，而且实验结果不令人满意，为此进行多次研究探讨，进行模拟，对这一实验方法进行了改进，使得实验时间缩短，实验准确，层析分离的效果明显。
二、材料、仪器和方法
1、材料、用具
新鲜的绿色叶片
丙酮苯石油醚干燥的定性滤纸剪刀二氧化硅碳酸钙烧杯(100ml)天平研钵小玻璃漏斗尼龙布毛细吸管
2、实验方法
层析方法：
(1)条形滤纸层析(2)圆形滤纸层析
画滤液细线的方法:
(1)毛细吸管法(2)硬笔法(3)芒箕法(4)印泥法
3、实验流程
提取色素→制备滤纸条→画滤液细线→分离色素→观察→结论
小试管量筒
叶绿素的分离与提取的实验探究
生物系:王玲
指导老师:江娟
(湖北师范学院生物系湖北黄石435002)
摘要:在叶绿素的提取与分离实验中，对操作方法进行了探究，提出了实验中的注意事项常见原因及对策.其中对滤纸划线方法设立了对照实验,从而对划线方法进行了重点改进，以确定最好的方法.
关键词:色素提取划线
中图分类号：Q2-33
一、实验过程
1、提取绿色叶片中的色素
将除去叶柄和粗叶脉的5g左右新鲜绿色叶片（菠菜叶或白菜叶、女贞叶），剪碎，放在研钵中，加入少许二氧化硅和碳酸钙，进行充分的研磨，当研磨成糊状时，再加入5-6ml丙酮，用杵棒迅速搅动后，静止3-5min，就可看到丙酮提取液为深绿色，再将澄清的提取液直接收集到有色的小广口瓶中（不经过滤）。丙酮具有一定的毒性并且很容易挥发。在进行实验操作时尽量少吸入丙酮，搅动后静止时，用纸或塑料薄膜盖在研钵上。因为叶绿体中的各种色素都是脂类化合物，不溶于水，只溶于酒精、乙烷、丙酮、石油醚等有机溶剂中，且用丙酮的效果较好，加入丙酮就是为了快速提取色素。又因丙酮的化学性质不稳定，极易挥发，所以必须在充分的研磨后加入，而不在研磨前或研磨中加入。在实
验过程中，发现在研钵中加入2ml丙酮，数量不足，色素提取液量不多，如果再经脱脂棉过滤，滤液几乎全被吸走，提取色素困难，所以改成加入丙酮5-6ml。将色素收集到有色的小广口瓶中，目的是避免叶绿体中的色素，在接触空气或光照下遭到破坏。
2、制备滤纸条
取一张预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成8-9cm长，1cm宽的滤纸条，再将滤纸条的一端对折剪去两角。
3、画滤液细线
用牙签（或用钢笔尖、六号注射针头等）代替毛细吸管，蘸取有色小广口瓶中滤液，沿铅笔线处小心均匀地划出一条滤液细线，划的线条越细越齐（直），而且待滤液干燥后，继续重复画4～5遍，实验效果越好。
(1)毛细吸管法
线，先制备滤纸条，然后用毛细吸管划滤液细细线干燥后重复划三次，最后一次完后用直只测量其细线
(2)硬笔法
滤液划线。
(3)芒箕法芒萁是一种分布广泛的蕨类植物。取一细长的芒萁茎从中间处上下折拗，使其茎断而茎内中柱不断，拍抽茎内中柱，把中空的芒萁茎折成7厘米长，用小刀把其一端削成斜面，吸取滤液划线。
(4)印泥法取风干后的绿色叶片5克于汤钵中，加少许二氧化硅和碳酸钙，研磨几分钟后再加2毫升丙酮，迅速研磨成匀浆：将匀浆平摊在一个培养皿内，上盖一小块纱布，制成一块绿色的“印泥”；然后用盖玻片的一测为“印章”，蘸取“印泥”中的匀浆，在制备好的滤纸条铅笔线上印一下，干燥后复三次。
4、叶绿体中的色素分离
将4ml层析液倒入100ml烧杯中，再将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）略微倾斜靠着烧杯的内壁，轻轻地插入到层析液中，
宽度。如此制取5条滤纸带。取一未装过墨水的新钢笔洗净，甩干水后吸取
随后用培养皿盖盖上烧杯，滤纸上的滤液细线要与层析液离开一定的距离，即层析液不能没及滤纸条上的滤液细线。
5、实验结果的观察
层析几分钟以后（约4～5min），滤纸条上便清楚地呈现出四条色素带，从上而下依次是胡萝卜素（橙黄色），叶黄素（黄色），叶绿素a（蓝绿色），叶绿素b（黄绿色）。取出滤纸条，待滤纸条稍干燥后，随堂观察实验结果，或待滤纸条完全干燥后，粘贴在实验册的报告栏上，避光保存。（注：为了加速干燥，可以用嘴对着滤纸条轻轻地吹，但不能放在阳光下晒。）
二、实验改进
1、提取液的改进
除丙酮外，也可用酒精替代，结果大致相同。和酒精相比，丙酮有一定毒性，因而不妨换一下；另外一种提取液是：在加入丙酮2～3ml后，再加入2ml石油醚，可以提高胡萝卜素提取效果，色素带分离现象更明显。
2、层析液的改进
层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂，教材上给出了两种层析液配方：一种是93号汽油，另外一种为20份石油醚，2份丙酮，l份苯混合而成。采用下列配方实验效果也不错：
（1）四氯化碳加少许无水硫酸钠；
（2）95％的酒精；
（3）9份95％酒精加1份苯；
（4）20份汽油，2份丙酮，2份石油醚，1份苯。
其中，采用配方（4）效果最好，配方（2）经济而且简便一些，但效果有一定折扣。
3、设立对照实验
设立一个空白对照组，在其他条件完全相同的情况下，一个画滤液细线，而另外一个不画，结果进行对照，消除“不同色带
是层析液在滤纸上扩散后留下的颜色”的怀疑。这样同时也培养严谨的实验作风，体现生物学科研的基本原则。
4、实验方法探索
本实验不仅可用条形滤纸进行层析，还可以采用圆形滤纸层析办法：取平面培养皿1只，铺一层细纱(厚约0．5cm)，将滤纸剪为圆形放人培养皿中，在圆形滤纸中央点上滴2滴色素提取液，静置约1min，然后依次滴35滴层析液，每滴中间间隔30s，然后盖上培养皿盖，几分钟后，可以观察结果会得到近似同心圆的4个色素环，由内而外分别是黄绿色、蓝绿色、黄色、橙黄色。此实验关键有两点：一是几次滴液体要在同一点上，否则不能形成圆环；二是滴层析液的量和时间要掌握好，否则会影响效果，甚至失败。
三、实验失误的常见原因及对策
1、滤液过稀
提取色素液操作时，方法欠妥，滤液黄绿色，浓度稀，实验效果欠佳，只有深绿透明的滤液，才能达到好的分离效果。
（1）材料选用不当，有的绿叶材料，不都是效果最优的，不能盲从。选用老叶、革质、蜡质的叶片，就难以研磨充分。宜选老嫩适中且浓绿的叶，如：菠菜、青菜、天竺葵、马铃薯、苷薯的叶。
（2）所选叶片剪得不碎，加之研磨不充分。实验操作时，尽可能剪碎叶片，可把几张叶片叠放一起，先剪成丝，再一起横着剪碎，这样省时省力。加入少许SiO2，CaCO3且迅速充分研磨，研120转左右，使研磨液呈匀浆状为好，这样各种色素才能充分溶解在提取液里(丙酮或无水乙醇)。
（3）过滤时，漏斗基部的脱脂棉太多(或"尼龙布"不是单层)。过滤时，使用脱脂棉尽可能少，便于得到深绿色的透明滤液，能阻挡住叶渣即可。切忌用过滤纸过滤，否则色素被吸收，降低
滤液中色素的浓度。
（4）加入提取液过多，导致滤液中色素含量低。对策是将稀提取液和新添碎叶放入研钵再研。此法也是上述的补救措施。
2、滤液不纯
提取液含有过多的杂质或变质，会严重影响实验结果。
（1）叶片表面含有水珠或叶片内含水量过高，降低提取液对色素的抽提效率，且影响层析。对策是用吸水纸或脱脂棉擦去叶片表面水珠，不用过嫩的叶，必要时加少许脱水剂硫酸钠。
（2）加入过多的二氧化硅和碳酸钙，这样既影响过滤，又使滤液中有颗粒物，降低滤液浓度。对策是控制用量，一般各加0.1g。(SiO2起研磨粉作用，破坏细胞结构。CaCO3与有机酸反应，是叶绿素的保护剂)。
（3）滤液存放时间过长，光线和空气的作用，缓慢的有机反应，将溶解的色素破坏，溶液变为褐色，即叶绿素卟啉环中的镁可被H+或Cu2+所取代。液泡膜破裂流出的鞣酸、草酸等有机酸产生的H+置换了叶绿素中的镁后，可以形成褐色的去镁叶绿素。
3、滤液线画得过细
画好滤液线既是实验的难点，又是实验的关键，否则现象不明显。
（1）滤液线画得不匀实。原人教版教材上讲越细越齐效果越好，新老教材上都讲画滤液细线，极易产生误导。导致学生画的滤液线过浅，线上色素量太少，其实最关键的是画线后绿色较深。实际操作中，每画一次、用电吹风吹干，可重复几次，便于积累色素成分，力求深、齐、匀，线粗1～2mm，可用医院验血时用来吸血的毛细吸管画。
（2）滤液线画得距滤纸剪角端太近，易使色素溶解于层析液中，不能在滤纸条上向上扩散，距剪角端1.5cm处画线，层析速度适中，效果最佳。
四、结论
四种划滤液细线方法的比较表(单位；毫米)
方法滤液
细线宽度
第一条
第二条
第三条
第四条
第五条
平均宽度毛细吸管法5.15.25.04.85.05.02硬笔法2.12.01.92.01.81.96芒箕法4.24.04.13.84.54.12印泥法3.03.83.13.53.23.32
色素分离效四条色素带四条色素四条色素四条色素带果
1
2较明显带明显带明显不明显用毛细吸管划出的滤液细线宽度为5毫米左右，色素分离用钢笔等硬笔划线是一种较好的方法，划出的细线又细又效果好，但划线时容易折断。整齐。钢笔人人有，挤掉墨水。洗净甩干就能用，适于学生做分组实验。缺点是若滤液不够纯净，常常会出现笔尖不下水现象。
3芒箕茎是毛细吸管理想的替代品，它韧性很好，不易折断。芒其遍布大江南北，材料易得。芒箕茎在色素分离实验中还有一个很大用途；把一较长的芒箕折成“门”形，高度略低于装层析液的烧杯，宽与烧杯直径相同，插入烧杯，就可把多条一端折叠的划好滤液细线的滤纸条挂靠在芒箕茎上进行层析；滤纸条之间保持一定距离，纸条长度还可随意折叠调节，又不影响盖培养皿。
4采用“印泥法”，实验步骤大大简化，但实验效果一般，究其原因乃是大部分色素仍吸附在研磨渣和纱布中，挤压液中色素含量较低的缘故。
五、参考文献
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]全日制普通高级中学教科书（必修）第一册傅家渭.“叶绿体中色素的提取和分离”实验方法的改进，生物学通报，2002.12.《中学生物学》2002年第6期曹宏英.生物学通报，2003.Vol.38.No.5.61黄伟.张梅叶绿素提取和分离实验的改进生物学通报2003.Vol.38.No.2.56陈曾燕.探索教学尝试，生物学通报，2002.Vol.37.No12.41
wemadesomeimprovementintheexperimentofAbstract:
extractionandisolationofchlorophtll.especiallyonthetechniqueoffilterpaper’slineation.wemadeacontrastexperimenttowardsthemethordandcheckoutthebestmethord.
Keywords:pigmentextractlineation