大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
发布日期:2006-11-21 热门指数:6493 分享
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这都是我几年来经验总结啊,觉得有用一定要顶
大肠杆菌电转化感受态细胞制备
第一天：
1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养
2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用
3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用
第二天：
4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板∑恐?
5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时
6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次）
7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）
8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）
9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液
11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞
12. 离心，弃上清液
13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）
15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml
16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存
转化方法:
1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟
2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟
3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中
4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT
5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中
7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原
8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养