提高免疫组化染色质量的相关处理和操作

恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是［1］决定染色成败的内部因素。在组织细胞准备过程中，不仅要求保持组织细胞形态的完整，更需要保持组织或细胞内的抗原，使之不受损失或弥散，防止组织自溶。很显然，在一张组织或细胞已坏死、抗原已丢失的材料上，再好的技术和抗体也难以成功染色。本文就组织标本及时取材、固定、组织脱水和包埋、切片以及免疫组化规范操作等过程进行分析与讨论，旨在与技术人员一起学习交流，以提高免疫组化染色的质量，为病理诊断提供有力保证。

1 组织标本及时取材

1.1 组织标本

包括实验动物标本、活组织检查标本、手术切除标本和尸体解剖标本等。一般常用者为实验动物标本、活组织检查标本和手术切除标本。组织块大小以2cm × 1.5cm × 0.3 cm为宜。

1.2 取材原则

取材器械如刀、剪、钳，刃口必须锐利，以免组织因受压而变形。取材部位应是主要病变区及病灶与正常组织交界处。取材前先除去表面坏死组织并防止组织干涸，一旦组织干涸，则无论怎样取材也不能获得满意的染色效果。另取远离病灶的正常组织作对照。用作石蜡包埋的组织厚度不宜超过0.3cm，用作冷冻切片的组织厚度以 0.3～ 0.4cm 为宜。取材操作要准确、快速。取材后应立即固定组织( 固定液量应大于组织体积 20 倍以上) 或制成冷冻切片。新鲜组织若不能立即制作，可贮存于液氮内或－70 ℃ 冰箱内。

2 固定

组织或细胞固定的目的是使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外源性或内源性酶的反应，防止细胞自溶，以保持组织细胞的固有形态和结构，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，防止抗原的丢失或弥散。因此，标本应尽可能保持新鲜并及时进行固定。由于抗原的稳定性不同，所选固定剂的种类、固定时间及温度都应注意。常用的固定剂通过两种途径固定抗原，即交联性固定和蛋白沉淀性固定。常用的交联性固定剂是甲醛和戊二醛。应用此种固定剂，组织收缩小，但渗透较慢，且因交联而使抗原遮蔽，并可造成某些抗原成分的破坏和丢失。蛋白沉淀性固定剂的代表是乙醇，乙醇能较好地保存酶、肽类等组织抗原。虽然乙醇易使组织收缩变形，但对免疫组织化学来说，仍不失为一种较好的固定剂。类似的固定剂还有甲醇和丙酮。

2.1 固定液

2.1.1 甲醛固定液

常规的福尔马林固定可以检测多种抗原。由于保存的福尔马林常发生酸化，因此用 0.01 mol/L磷酸缓冲液( PBS) 稀释成 10% 福尔马林液( pH 7. 4) 常获得较好的效果。现代的免疫组化方法极为敏感，尽管有的抗原在染色前已丢失很多，但还能被较好的显示出来。醛类固定剂的交联作用，常形成抗原的遮蔽。用蛋白酶消化处理，以打断分子间的交联，使抗原暴露出来，从而明显改善了免疫组化的染色效果。不同的抗原成分对固定剂有不同的要求，因此应针对性地选择固定剂及固定条件。

2.1.2 丙酮 丙酮的组织渗透性和脱水性较强，常用于冷冻切片或细胞涂片的后固定，以冷丙酮(4 ℃) 固定 5～15min，取出自然干燥后，贮存于低温冰箱内备用，可以较好地保存抗原，尤其是对一些较脆弱的抗原。

2.1.3 乙醇 因纯乙醇的穿透力差，选用 95% 的浓度室温固定。由于抗原性保存较好，亦可用于组织或细胞的固定。

2.1.4 4%多聚甲醛磷酸缓冲液

多聚甲醛40g，0.01 mol/L PBS，pH 7.4，1 000 ml，60 ℃ 混合加热至两者全溶。注意温度勿过高，以免甲醛蒸汽逸出。

2.1.5 戊二醛—甲醛液2.5%戊二醛1ml，浓甲醛10 ml，蒸馏水加至100ml。

2.1.6 醋酸—甲醛液40%甲醛液10 ml，冰乙酸3ml，加生理盐水至100ml。

2.1.7 Bouin液 苦味酸 75ml饱和液，福尔马林25ml，冰乙酸5ml。此液的组织穿透力较强而收缩性较小，为免疫组化常用固定液之一。

2.1.8 Carnoy液 无水或100%乙醇60ml，氯仿30ml，冰乙酸10 ml，混合后4 ℃保存备用。

2.1.9 三聚乙醛液 三聚乙醛1g液溶于0.072 mol/L( pH 7.5)二甲胂酸钠缓冲液100 ml，另加蔗糖0.72g，于60 ℃ 充分搅拌溶解。此液常用于免疫荧光标记。

2.2 固定方法

2.2.1 浸入法

将取材组织立即浸泡在固定液内，必要时可在低温(4℃) 固定，固定时间一般在2 ～ 12 h。

2.2.2 灌注法

适用于实验动物研究。用插管由左心室插入主动脉，先用 PBS 冲洗血液，再以泵或吊瓶灌注固定液(若取脑组织于4 ℃灌注更好) 。灌注量按动物大小而定。一般在灌注后30 min内取材，所取组织再置同一固定液内浸入固定 1 ～ 3 h。灌注法可使固定液迅速到达全身各处组织，以达到充分固定的目的。

2.2.3 微波固定

此法依据微波处理后，标本温度升高，分子运动加快，促进固定液向组织内渗透，短时间达到固定效果。可采用家用微波炉，将标本材料放入5～10ml 固定液内，置于炉内旋转台周边，中央放一烧杯盛300～500ml纯水或加少量冰块以吸收炉内产生的热量，选择强档照射10～30s，照后固定液温度≤50 ℃ 。取出后，在相同固定液内再固定 2 ～ 6 h( 室温) 。

3 组织脱水和包埋

3．1 脱水、包埋程序

用于免疫组化的石蜡包埋与常规石蜡包埋的要求稍有不同: 脱水、透明等过程应在室温下进行，尽量减少组织抗原的损失。组织块大小以 2cm×1.5cm ×0.3cm 为宜。浸蜡和包埋的石蜡应控制在 65 ℃ 或 65 ℃ 以下。组织块脱水、透明、浸蜡时间推荐如下:

(1) 固定程序 2道 固定液为 10% 中性缓冲甲醛液，时间为 45 min，设置加温50℃ ，加压，搅拌。

(2) 脱水程序 8道 前4道为95%乙醇，后4道为100%乙醇，时间均为60 min，仅在最后1道的95% 和 100% 乙醇设置加压，搅拌。

(3) 透明程序2道 第1道为硬脂酸和石蜡，比例为 3∶2，第2道为硬脂酸和石蜡，比例为 2∶3，时间均为60 min，均设置加温65 ℃ ，加压，搅拌。

(4) 浸蜡程序 2 道 均为 56 ～ 58 ℃ 纯蜡，时间均为 60 min，设置加温 65 ℃ ，加压，搅拌。

3.2 包埋方法

3.2.1 石蜡包埋 以熔点低的软蜡包埋(即低温石蜡包埋) 为好。

3.2.2 冷冻干燥包埋法

此法原理是将新鲜组织块低温速冻，利用真空去除组织内所有的水分，使石蜡直接浸入组织制成蜡块。此法可保存组织内可溶性抗原，防止蛋白变性和酶失活，用于免疫荧光标记、免疫酶标记和放射自显影。

3.2.3 塑料包埋法

采用乙二醇甲基丙烯酸酯或环氧树脂( Epon 812 或 618) 包埋，其切片可同时作光镜及电镜检测抗原，定位准确。

4 切片

4.1 载玻片和盖玻片的处理

4.1.1 清洗

由于免疫组化染色周期较长，且要经过多次孵育和漂洗，有时还需要蛋白酶的消化，因此如果载玻片不经适当处理，切片常会逐步脱失，甚至完全脱落，导致染色失败。常用的处理方法是将载玻片或盖玻片用洗衣粉浸泡4h，流水漂洗 4 h，蒸馏水冲洗控干。

4.1.2 涂粘片剂

经过处理的载玻片，还需涂抹粘片剂，以防脱片。常用的粘片剂有:

①多聚赖氨酸 取多聚赖氨酸(poly-L-lysine PLL，相对分子质量大于 7.0×104 ) 0.5g 加蒸馏水 50 ml 制成，4 ℃ 保存。使用前加蒸馏水(1∶10) 稀释，放入载玻片浸泡 5 min，60 ℃ 烤箱烘干 1 h 或室温过夜干燥后备用。

② 3-氨丙基三乙氧基硅烷 ( 3-aminopropyltriethox-ysilane，APES) 取 APES 制成 1 ∶ 50 丙酮溶液，现用现配。将洁净载玻片放入，20～ 30s 取出，稍停，用纯丙酮或蒸馏水涮去未黏附的APES，置通风橱晾干即可。以上方法以多聚赖氨酸常用，粘片效果较好，但价格较贵，宜单面推涂。

4.2 石蜡切片

免疫组化的切片常来自蜡块，石蜡切片质量的好坏，直接影响染色的效果。石蜡切片的组织结构保存良好，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致，应用范围广，切片厚度 2～7μm，还可制备连续切片，是免疫组化常用的制片技术。所制的蜡片或蜡带，由上述制备的载玻片捞取后，置37 ℃ 温箱内过夜，可减少脱片。若长期保存，可置 4 ℃ 冰箱内。

以低温石蜡(56 ℃) 包埋的组织块，用锋利的切片刀或一次性切片刀切出没有刀痕、均匀的薄片最为理想。裱片时应注意将组织片贴附于粘片剂处，切忌皱折和裂口。因皱折和裂口处常造成非特异性着色。裱好的切片应竖直放置片刻、沥干水分，而后置于56 ℃ 温箱中烘烤24 h，即可染色。

4.3 冷冻切片

冷冻切片的最大优点是能够保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原。为避免在制备冷冻切片时的冰晶形成，必须使组织温度骤降，可采用液氮速冻方法。将组织放置软塑料瓶盖(或事先用 OCT 包埋浸没组织) 内，再把装有组织的瓶盖缓缓投入液氮内 10～20 s，取出置于 －70 ℃ 冰箱贮存或置入恒冷箱内切片。切片最好采用恒冷箱切片机进行切片。切片机置于 －30 ℃ 低温密室内，不受环境温度变化的影响，切片时低温，室内温度以 －18～－15 ℃为宜。切片薄达 4～6μm 而且可制连续切片。

冷冻切片或细胞学标本，经空气干燥后，置冷丙酮 (4 ℃) 中固定 10 min 后，即可染色。

5 免疫组化规范操作

免疫组化是一个多步骤、多条件的复杂过程，每一步骤都会影响最终的结果。因每一步骤都有其特定的条件，应严格按照特定的条件进行操作。对结果影响较大的因素主要［2］为是否进行热修复和抗体的问题。

5.1  修复的问题

关于抗原是否修复，存在着不同的意见。欧洲专家一致认为不能进行，以免产生假阳性，而美国学者的意见是需要进行，中国专家组推荐可以进行修复。如CD117 ，采用 EnVision 两步法，柠檬酸缓冲液( pH 6.0) ，使用高压锅进行免疫组化热修复。具体的操作程序: 将切片放在金属架上(不宜太密) ; 高压锅加入 0.01 mol/L 枸橼酸钠缓冲液 3 L，煮沸; 金属架放在枸橼酸钠缓冲液内，加盖，加压 1～5 min; 自来水浴冷却高压锅;自来水洗，Tris 缓冲液冲洗。

5.2 抗体的问题

免疫组化一般多选用单克隆抗体，单克隆抗体的效果好于多克隆抗体。抗体的效能，工作液使用方便，但是长时间放置后效能降低。

5.3 免疫组化染色分析

5.3.1 染色的结果

一般可分为两类: 无色片(即无阳性信号) 和“杂音”染色片(有阳性信号) 。免疫组化阴性情况，即染色结束后，切片中无任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这样的情况有两种可能: 真阴性的结果和假阴性的结果。

5.3.2 真阴性的结果

整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。

5.3.3 假阴性的结果

即此阴性结果不是真实的反映。切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。染色过程中的某一或某些环节出现问题。比如，组织未进行抗原修复，因为有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达; 选用了只能用于冷冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程。但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和( 或) 已超过有效期是主要的原因。

5.3.4 解决阴性染色的措施

在免疫组化操作过程中设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。通过观察组织的内对照，也可以进行判断。如 CD117 ，可以从肥大细胞的染色情况来判断是免疫组化过程中出了问题还是本身组织就不表达CD117。因为正常的肥大细胞可以表达CD117，主要在细胞膜或胞质表达。

参考文献:

［1］王伯沄，李玉松，黄高昇，等． 病理学技术［M］． 北京: 人民卫生出版社，2000: 354 － 66．

［2］吴秉铨，刘彦仿，主编． 免疫组织化学病理诊断［M］． 北京: 科学技术出版社，2007: 15 － 22．

温馨提示

本文来源：临床与实验病理学杂志