人体细胞的低温保存与冷冻干燥

16制冷技术　　　　　　　　　　　　　　　2007年第2期

制冷节论　文之　二

人体细胞的低温保存与冷冻干燥

华泽钊

(上海理工大学　上海200093)

【摘　要】　本文阐述了细胞和组织的低温保存和冷冻干燥的意义、现状、以及所研究的技术科学问题。包括低温损伤与溶液

冻结相变的传热传质过程的关系; 降温和复温过程的热分析和热控制; 低温保存的玻璃化理论; 水溶液的非晶态化特性的研究; 一些新的技术手段和仪器设备; 组织工程化细胞和组织的低温保存; 活细胞的冷冻干燥。　低温生物医学技术; 低温保存; 冷冻干燥; 水溶液的非晶态化; 组织工程; 微胶囊技术【关键词】

1　低温生物学、低温医学与低温医学技术

科学工作者之擅长。这年来, 一批物理学家、工程学家、究, , 、工程学的理, , 对低温生物, 进行全面深入的研究; 形成了生物学、医学和热科学、工程技术相结合的交叉学科, 被称为

(Cryobi omedical Techniques ) 。“低温生物医学技术”2　低温保存与低温损伤

211　细胞和组织低温保存的意义

在生物和医学中, “低温”所指的范围可以从稍

低于正常体温(37℃) 直至低于4K 。从目前实际研究内容和范畴出发, 我们认为可以定义低温生物学(Cryobi ol ogy ) 其应用的学科。伤及其防治、低温酶学; 动植物细胞、; 食品、药品的冷藏保存和冷冻干燥; 还包括电镜生物样品的低温制备技术等等。而低温医学(Cryomedicine ) 可以被定义为研究温度降低对人类生命过程的影响, 以及低温技术在人类同病斗争中的应用的学科。它包括人的冻伤、低温麻醉、低温脑复苏等; 人体重要细胞组织、器官的低温保存、移植及临床应用; 低体温医疗; 利用低温手术器械杀伤异常组织如肿瘤等。

由上述可见, 低温生物学和低温医学所研究的内容有很多是共同的, 因为人也是生物体。当然, 低温生物学除了研究人以外, 还研究其他生物体, 特别是有重要意义的动植物; 而低温医学则更侧重于临床效果。两者互相依赖、互相补充, 故许多人将它们统一称为低温生物医学。

在低温生物医学中, 目前发展最快、影响最大的是细胞和组织的低温保存。从本质上来说, 低温生物学是由于温度这个物理量的变化而引起生物体的影响。生物体的主要成份是水, 被保存的细胞也常是被放置于一定的溶液中降温的。温度的降低会引起细胞所处的溶液中产生冰晶生长、溶液浓度升高等变化, 可能损伤细胞并使之死亡。

上述这些由于温度变化而引起的物理化学变化及其控制, 正是物理学家、工程学家、特别是制冷和热

人体细胞、组织、器官的同种异体移植, 是临床上救治重症病人的重要技术手段。目前, 每年世界上大约有几千万人, 我国有几百万病人需要通过组织或器官移植。据统计, 国际上器官供体来源, 20%来自活体近亲; 80%来自死后捐赠。供需在时间方面存在着很大的矛盾, 即供体的捐赠和受体的临床移植之间存在着时间差, 就要求能够实现低温保存。

低温能抑制生物体的生化活动。生物体内一切新陈代谢过程中的变化, 虽因由酶所催化而表现出多种特殊形式, 但仍然都服从于某些共同的物理化学规律。如果按照A rrhenius 关系估算温度对化学反应速度的影响。

若一生物体在4℃环境下能存活2小时, 那么按理论, 它在-40℃下能保存数日, 在-80℃下可保存数月,

k =A exp (-E a /RT )

而在-196℃下可望保存几个世纪。

许多实验已证明, 经成功低温保存的细胞和组织在-196℃保存数十年, 复温后进行检查, 没有发现任何生化和功能上的变异。有人将红细胞的温度一直

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降至-272129℃, 复温后未见任何变异, 这说明低温保存并未发现有温度的下限。212　生物体极易在降温和复温过程中受损伤而死亡

生物体虽能在低温下长期保存, 但却极容易在降温和复温过程中受溶液冻结、融化、以及溶液渗透压力变化等因素的作用而损害。这种低温损伤主要发生在0℃到-60℃这段温度范围内, 我们称这个温度范围为“危险温度区”。

为了实现细胞的低温保存, 一般均需在溶液中加入一定种类和浓度的低温保护剂(Cryop r otective agents ) , 如甘油、二甲亚砜、甲醇、聚烯吡酮(P VP ) 、聚乙二醇(PEG ) 等。并针对不同的细胞, 设计特定的降温程序和复温程序等。没有上述特定的条件, 细胞在降温、复温过程中必然会遭到低温损伤而死亡。213　防止低温损伤的热学原理

在常温下, 态; 细胞内、, 中, 根据传热的原理, 的凝固点以下; 而对此类富含水的溶液, 析出的固相几乎是不含溶质的纯冰, 致使胞外的液体溶液的浓度升高。这样, 细胞内外就存在着温度差和浓度差(渗透压) ; 它们分别是传热和传质的驱动力。

对于细胞体积很小、比表面积很大、细胞膜的水渗透率很高、冷却速率很低的传热控制的过程, 在冻结过程中细胞过度脱水、严重皱缩; 同时细胞在不很低的温度下、在高浓度的溶液中所经历的时间过长。这些都导致细胞的损伤以至死亡; 这种损伤被称为“溶液损伤”, 或“溶质损伤”。反之, 对于传质控制的过程, 胞内冰的形成和再结晶会对十分精致和脆弱的细胞膜产生损伤, 而导致细胞的死亡。这种损伤被称为“胞内冰损伤”。

数十年来, 针对不同的细胞和组织, 低温生物学家一直在寻找不同种类和浓度的低温保护剂; 寻找不同的合理的降温和复温程序; 以求找到一种较合理的、既能防止“胞内冰损伤”, 又能避免“溶液损伤”的途径。亦即在传热与传质过程中寻求一个最合理的控制过程。214　低温保存的玻璃化理论

近年来, 人们已逐渐地认识到, 凡是成功的低温保存, 细胞内的溶液均以非晶体(玻璃态) 的形式被固化; 在胞内没有晶态的冰出现。液体被冷却连续地

固化成为玻璃体, 这个过程被称为玻璃化转变(vitrificati on ) 。玻璃化转变是一个非平衡的动力学过程; 具有热容量发生突变的特征。

虽然玻璃态是处于亚稳态的固化了的液体, 但它

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的粘度要比一般液体高约10倍, 因此在实用的时间范围内, 可以认为是稳定的。对于不同的体系, 要实现液体的玻璃化转化所需的冷却速率相差极大。如

-3

对Si O 2, 只要10K/s 的冷却速率就可使200c m 厚的材料实现玻璃化; 欲实现315c m 厚Ge O 2材料的玻璃化, 只需要0. 35K/sec 的冷却速率; 但对于纯水, 即

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μm (微米) 的玻使高达10的冷却速率也很难实现1

璃化固体。生物体都是含水量很高的体系, 要实现玻璃化的难度极大。3　人体细胞和组织低温保存的现况

经过数十年的研究, 存。, 都引起学术界的高度重视。我们多年来在血细胞、皮肤、血管、气管、胰岛组织等低温保存方面取得了很大进展, 并在临床上得到应用。

但是总的说来, 复杂组织和器官的低温保存问题, 并没有完全解决, 目前成功的只是部分。只有进行系统深入的基础研究, 才可望能较彻底、较全面的解决问题。

不时有报道, 说是有人已经实现整个人体的冷冻复活。国内有人扬言要筹资20亿来搞所谓:“人体冷冻复活计划。”有人说是幻想:有人认为是商业炒作。北京科技报和上海的新民周刊, 均曾采访过我。美国有些机构的确是在进行人体冷冻的实验, 但是从来没有活过来的例子, 他们要求参加国际低温生物学组织, 也没有获得同意。生物体按照复杂程度分为细胞、组织、器官、人体, 按照目前低温生物医学的水平大部分细胞以及部分组织能低温保存, 但是心脏之类的器官还未能低温保存。简单地把人放到-196℃的液氮中就希望能保存, 是不现实、不科学的。真正的科学是有发展规律的, 从简单到复杂, 简单问题还没有解决, 复杂的问题怎么就能解决, 不是蛮干就是能实现的, 还是要踏踏实实地从基础开始做。4　冷冻干燥技术及应用

冷冻干燥技术(freeze -drying, lyophilizati on ) 是将富含水物质在低温下冻结; 然后在真空条件下, 通过对冻干物料的加热, 使冰升华; 再在真空条件下加

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st orage )

热, 除去吸附水, 得到干的制品。

现代药品大多是热敏性药品, 即对温度(主要是高温) 比较敏感的药品。在生产热敏性药品时, 为防止由于温度过高而使药品变性, 影响产品的质量, 目前广泛应用真空冷冻干燥技术。用这种方法制造的药品的特征是:结构稳定, 生物活性基本不变; 药物中的易挥发性成份和受热易变性成份损失很少; 呈多孔状, 药效好; 排除了95-99%的水分, 能在室温下长期保存。

冷冻干燥主要由以下几个过程组成:

1) 物料的预处理或制备(p reparati on, p retreat m ent )

在对细胞冷冻干燥之前, 必须加入一些添加剂, 以保证冻干产品效果良好、保持药品的活性和保持细胞的存活。

2) 物料的冷却固化过程(freezing, s olidificati on ) 此过程是将物料充分冷却, 由水完全结成冰; 化, 形成固态的非晶体料, , 、坚硬的网状结构。

3) 升华干燥(一次干燥) 过程(subli m ati on drying, p ri m ary drying )

物料中的水分, 对冷冻干燥过程的分析而言, 可以划分为两类。一类是在低温下可被冻结成冰的, 这

(free water ) 或“部分的水可以称为“自由水”物理截留水”; 另一类是在低温下不可被冻结的水分, 这部

分的水可以被看作是被“束缚”的, 称为“结合水”或

(bound water ) 。对于含水量高的物料, 其“束缚水”

中“自由水”的含量约点总水分量的90%以上。

4) 解吸干燥(二次干燥) 过程(des or p ti on drying, secondary drying )

在第一阶段干燥结束后, 在干燥物料的多孔结构表面和极性基团上还吸附有未被冻结的结合水。由于吸附的能量很大, 因此必须提供较高的温度和足够的热量, 才能实现结合水的解吸过程。但温度又不能过高, 否则会造成药品过热而变性。

解吸干燥, 又称二次干燥, 是在较高温度下加热, 使物料中被吸附的部分“束缚水”解吸, 变成“自由”的液态水, 再吸热蒸发成水蒸汽。

在冷却固化过程、升华干燥和解吸干燥过程中, 物料的温度和含水量的变化如图1所示。

5) 封装和储存(conditi oning -packing and

经二次干燥后, 要进行封装和储存。在干燥状态下, 如果不与空气中的氧气和水蒸汽相接触, 冻干药品可以长时间贮存。待需要使用时, 再将其复水(rehydrati on )

。

图1　冻结和干燥过程中物料的温度和含水量变化的示意图

5　冷冻干燥系统的主要组成

冷冻干燥系统主要由干燥箱(或称冻干箱) 、冷阱、制冷系统、真空系统、加热系统和控制系统等组成, 如图2所示意

。

图2　冷冻干燥系统主要组成的示意图

从目前技术发展的程度来看, 我们大致可以将冷

冻干燥的应用分为以下几类:

1) 食品和微生物的冷冻干燥:相对地说, 微生物、咖啡、牛奶的冷冻干燥是技术比较成熟的应用领域; 而水果、蔬菜的冷冻干燥是新兴的与人民生活关系密切的高附加值的技术。

2) 生物药品的冷冻干燥是近10年来冷冻干燥界最关心、投入研究力量最多、最重要的应用领域。

3) 人细胞的冷冻干燥, 可望给临床医学带来新的变革, 是目前国际学术界十分关心和积极研究的问题, 但仍处于探索阶段。

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4) 冷冻干燥在其他领域中的应用。

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冷冻干燥技术在皮肤、角膜、骨骼等的保存, 组织工程支架的制备等方面获得了重要的应用。冷冻干燥技术也是材料科学中制备精细陶瓷粉末、催化剂粉末、超细的金属粉末、合金粉末、记录用的超细磁性粉末等的新技术手段。在新型保健化妆品的研制、饱水文物的脱水、电子显微镜生物样品制备、动物和人体器官样本制作等方面, 冷冻干燥技术也显示了特色。6　人体细胞的冷冻干燥

如果能将人的细胞(如红细胞等) 进行成功的冷冻干燥, 那么人们就可以将自己的细胞, 通过冷冻干燥成为粉末, 密封在玻璃瓶内, 放在室温或冰箱中安全地保存数年或数十年。待急需时, 只要复水就能复活使用。人细胞的冷冻干燥是目前国际学术界十分关心和积极研究的问题, 但仍处于探索阶段。如果这种技术能获得成功, 将具有十分重要的应用前景, 并可望给临床医学带来重大的变革。

冷冻干燥困难得多, , 床应用。

从上世纪60年代起, 就有科学家研究红细胞的

冻干保存, 经历无数次的失败, 取得了初步成功。但到目前为止, 冷冻干燥红细胞的恢复率仍然低于50%, 说明了血液细胞冻干的复杂和困难。

关于血小板的冷冻干燥的研究, 也经历了约40年, 直到最近取得了突破性的进展。2001年Wolkers 等在血小板的冻干保存体系中添加了海藻糖, 使得冻干血小板复水后达到了85%的存活率; 2003年, 他们开始对冻干血小板的临床应用可行性进行研究。

脐血中含有大量未成熟的造血干细胞。与成年人细胞相比, 零岁婴儿未成熟的造血干细胞具有无污染、异体排斥反应小、免疫原性低等特点; 而且其再生能力和速度是成年人的10至20倍。从2001年起, 我们对人脐带血(human cord bl ood ) 全血(whole bl ood ) 和单核细胞(mononuclear cells, MNC ) 的冷冻初步得到较好的结果。(有核细胞) 的恢复率为, 75%,

。对冻干后的脐血检测CD34细胞

+

进行抗体跟踪检测, 得到的CD34细胞恢复率为60-68%。

+

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　　相变蓄热与水蓄热相结合的热回收方式用于热泵系统中, 能够很好的发挥相变蓄热与水蓄热各自的优势。在夏季可满足生活热水的需要, 冬季可以通过较好的控制策略, 利用负荷时间差达到制取生活热水的目的, 有效提高能源利用率, 为用户节省投资, 并且有利于环境保护。参考文献

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