原生质体诱变育种文

普那霉素产生菌的原生质体诱变育种

摘要： 普那霉素产生菌始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)11-2在含0．5％甘氨酸的种子培养基中培养到对数生长期，收集菌丝体,经2mg／ml溶菌酶在30℃下作用90min可获得大量的原生质体，其再生率为5．1％。始旋链霉菌11-2原生质体经UV诱变并在含普那霉素的再生平板上筛选普那霉素抗性菌株，从中获得一高产突变株始旋链霉菌ZP-07，普那霉素产量达到1.59g／L，比出发菌株提高101．3％。

关键词： 普那霉素； 原生质体； 诱变； 筛选

Selection of high pristinamycin-producing strain through mutation

of protoplast induced by UV radiation

ABSTRACT To select a high pristinamycin·-producing strain through protoplast mutation induced by UV radiation，factors affecting protoplast formation and regeneration were studied．Streptornyces pristinaespiralis 11-2 was cultured in a breeding medium containing 0.5％ glycine until exponential phase of growth；the mycelia were processed with 2mg／ml lysozyme at 30℃ for 90 minutes；the protoplasts were obtained and the regeneration frequency was 5.1％ ；the protoplasts of Ｓ．pristina- espiralis were induced by UV radiation；the mutants were screened on the regenerative plate

containing 20mg／L pristinamycin；and a pristinamycin—resistant mutant，S．pristinaespiralis ZP－07， was obtained,whose pristinamycin output reached 1.59g／L increased by 101.3％ compared with the starting strain．

KEY WORDS Pristinamycin； Protoplast； Mutagenesis； Screening

普那霉素(pristinamycins)属链阳性菌素类抗生素，由始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)产生，由约30％的普那霉素I和约70％ 的普那霉素Ⅱ组成，两者具有协同作用。普那霉素对革兰阳性菌有较强的杀菌活性，主要用于治疗由革兰阳性菌包括耐药菌引起的感染[1]。经过化学修饰得到的水溶性衍生物喹奴普丁／达福普汀对耐药性革兰阳性菌具有很强的杀菌作用，且有较长的抗生素后效应和不易产生耐药性等优点，是目前治疗由耐药的革兰阳性菌引起的感染最有效的抗生素之一[2]。

本文研究普那霉素产生菌始旋链霉菌的原生质体制备与再生条件，并进行诱变育种，以期获得高产菌株。

1 材料和方法

1．1 出发菌株

始旋链霉菌(S．pristinaespiralis)11-2。

1．2 培养基、溶液和试剂

斜面培养基、种子培养基、发酵培养基均参照文献[3]，再生培养基为R2YE培养基[4]，PB

液、微量元素、TES缓冲液等参照文献[4]。

1．3 培养条件

斜面培养条件、种瓶培养条件、发酵培养条件均参照文献[3]。

1．4 菌种处理

1．4．1 菌体生长曲线制备 在种子培养基中接入菌株始旋链霉菌11-2，按种瓶培养条件培养80h，每隔一定时间取10mL种子液，离心、烘干测定菌体干重，绘制该产生菌的生长曲线。

1．4．2 原生质体及单孢子悬液的制备

(1)原生质体制备 始旋链霉菌11-2新鲜斜面培养物在含一定浓度甘氨酸的种子培养基中培养一段时间后，收集对数生长期的菌丝，经玻璃珠打碎、PB液洗涤，用溶菌酶溶液于一定温度的水浴中酶解一定时间，每隔10min振荡一次，再用四层纱布过滤酶解液，滤液2000r／min离心5min，收集原生质体悬浮于PB液中，备用。

(2)单孢子悬液制备 刮取成熟斜面上的孢子，用无菌水制成孢子悬浮液，再将其装入内有已灭菌玻璃珠的摇瓶内振荡，将孢子打散后经滤纸过滤，即得单孢子悬浮液。

1．4．3 原生质体的再生及制备率、再生率的计算

将酶解前的菌丝涂布于琼脂平板上，28℃培养7d后计菌落数(以A表示)。将制备成的原生质体悬液按以下两个步骤进行：①经PB液稀释后涂布于再生平板上，28℃培养7d后计菌落数(以B表示)；②用无菌水稀释后涂布于再生平板上，28℃培养7d后计菌落数(以C表示)，此为未形成原生质体的菌落数。

1．4．4 紫外线对原生质体及孢子杀菌曲线的制作

将制备好的原生质体和孢子悬液(1．5×107个／m1)各取5ml，分别加入到直径为5cm的平皿中，置于15W紫外灯下，距离 30 cm照射10~80s。每隔10s取诱变原生质体悬液和诱变孢子悬液lml，适当稀释后吸取0.1m1分别涂平板，用黑布包好，28℃培养7d，统计菌落数，计算杀菌率。以紫外线照射时间为横坐标，以原生质体悬液和孢子悬液的死亡率为纵坐标作图。

1．4．5 普那霉素抗性平板制备 将不含普那霉素的再生培养基20ml倒入培养皿中，平放，待其凝固后再倒入5ml含有20 mg／L普那霉素的再生培养基，平放，即得。

1．5 分析方法

总糖测定采用斐林法[5]；氨基氮测定采用甲醛法[5]；pH值测定采用pH计；菌丝干重测定是用10ml发酵液，加50ml水，摇匀，过滤，用50ml生理盐水分数次洗涤滤饼，将菌丝抽气滤干，在真空烘箱中烘干至恒重，计算菌丝干重[5]；普那霉素浓度测定采用HPLC法[6]。

2 结果与讨论

2．1 始旋链霉菌11-2的生长曲线

由图1可以看出始旋链霉菌11-2的对数生长期为26~52h。处于不同生长时期的菌体经过处理都可以制成原生质体，但差异很大。处于稳定期和衰老期的菌体因为菌体老化生理活性低，制备的原生质体大、小差异很大，异质性明显，再生能力差；对数成长的菌体差异小，菌丝活力高，修复能力高，再生效果好[7]。故本文采用48h左右的菌体制备原生质体，此时菌体量大，菌丝活力高。

2．2 原生质体制备和再生条件试验

2．2．1 甘氨酸浓度对原生质体制备的影响 在种子培养时加入甘氨酸有利于原生质体的释放，其作用是在细胞壁合成过程中，甘氨酸错误地替代与分子结构相似的丙氨酸而干扰细胞壁网状结构合成，使酶液乘机而入，有助于瓦解细胞壁。有资料[8]表明放线菌甘氨酸浓度以0.2%-4%为宜。为考察甘氨酸浓度对原生质体形成的影响，本文采用0.1%、0.3%、0.5% 、0.7%、0.9%五个浓度进行试验，结果见图2。

图1 始旋链霉菌11-2种子生长曲线

图2 甘氨酸浓度对原生质体形成的影响

从图2可以看出，起初随着甘氨酸浓度的增加，原生质体浓度增加，在0．5％时达到最高浓度，之后原生质体浓度开始递减，说明低浓度甘氨酸对始旋链霉菌11—2的细胞壁影响不是很大，释放的原生质体较少；随着其浓度的增加，对细胞壁合成的干扰也加大，酶解时释放出了更多的原生质体。但甘氨酸对菌丝生长有抑制作用，所以随着甘氨酸浓度的继续增大，原生质体浓度反而降低了。因此在制备始旋链霉菌11-2原生质体时以在种子培养基中加人0．5％甘氨酸为宜。

2．2．2 溶菌酶浓度对原生质体制备和再生的影响 溶菌酶能水解放线菌细胞壁的主要成份肽聚糖，释放出原生质体。但酶的浓度应该适当，过高或过低都不利于原生质体的形成和再生。为考察溶菌酶浓度对原生质体制备和再生的影响，本文采用1、2、3mg／ml三个浓度，30℃酶解90min进行比较试验，结果见表1。

表1 溶菌酶浓度对原生质体制备和再生的影响(％

)

从表1可以看出，随着酶浓度的增加，原生质体的制备率增加而再生率却降低。这可能是因为酶量过低使酶解不充分，所以原生质体形成就少；而当酶量过高又使酶解过于充分，脱壁太彻底，使原生质体再生时失去细胞壁再生的引物，导致再生率较低。试验表明在酶浓度为2mg／ml时，原生质体的制备率和再生率之积最大[7]。因此在制备始旋链霉菌11-2原生质体采用2mg／ml溶菌酶进行酶解。

2．2．3 酶解时间对原生质体制备和再生的影响 酶解时间的长短能影响原生质体的制备和再生。本文在酶浓度为2mg／ml，酶解温度为30℃的条件下酶解不同时间制备原生质体，测定原生质体的制备率和再生率，结果见图3。

1：再生率； 2：原生质体数

图3 酶解时间对原生质体制备和再生的影响

从图3可以看出，随着酶解时间的增加，原生质体的形成量也相应增加，起初增加较快，90min后增加率变小，但再生率却随之降低，原因可能是酶解时间过长，细胞壁酶解过于充分，失去再生的引物而导致再生率降低。综合考虑原生质体的形成量和再生率，在制备始旋链霉菌11．2原生质体时，酶解时间以90min为宜。

2．2．4 酶解温度对原生质体制备和再生的影响 不同的酶具有不同的最适温度 l，菌株的生长也需要最适温度。温度过高或者过低不但对酶的活性有影响，也将导致原生质体活性降低，甚至被破坏。本文考查了酶浓度为2mg／ml、酶解时间为90min时，不同酶解温度(24℃、27℃、30℃、33℃ 、37℃)对原生质体形成和再生的影响，结果见图4。

如图4所示，原生质体的制备量和再生率在30℃时达到最大，酶解温度低于30℃时，原生质

体的制备量和再生率随温度的增加而增加，当酶解温度高于30℃时两者随着温度的增加反而降低。这可能是因为在低于最适酶解温度时，随着温度的提高，溶菌酶活性不断增高，原生质体的制备量和再生率不断提高。当酶解温度高于最适温度时，一方面酶的活性受到一定的抑制，另一方面温度升高会使原生质体的活性降低，甚至被破坏，导致制备量和再生率降低。所以制备始旋链霉菌11-2原生质体的最适温度为30℃。

2．3 紫外线诱变剂量的确定

紫外线对原生质体和孢子的杀菌曲线见图5。

原生质体较孢子悬液对紫外线有更强的耐受能力。这可能是由于原生质体形成后聚集成团，紫外线照射不均匀所致。经验表明，高诱变剂量突变率较高，但同时负变率也高；低诱变剂量突变率较低，但正变率较高。因此，目前紫外线诱变育种一般多采用较低剂量。根据紫外线杀菌曲线，本试验采用80％左右杀菌率的相对诱变剂量，即在紫外灯功率为15W，照射距离为30cm 的条件下，紫外线照射40s进行诱变。

2．4 普那霉素产生菌高产菌株的选育

始旋链霉菌1 1-2的单孢子悬液经紫外线诱变后适当稀释，涂布于平板上培养，同时始旋链霉菌11-2原生质体经紫外线诱变后也分别涂布于再生平板上和含有普那霉素的抗性再生平板上培养。未经诱变的始旋链霉菌1 1-2单孢子悬液适当稀释后涂布于平板上作为对照。从以上各组平板中均选取30个单菌落移种斜面，待斜面培养成熟后经摇瓶发酵测定普那霉素浓度，结果见图6。

图6显示紫外线诱变原生质体比诱变孢子的效果好，前者的平均产量是后者的145．5％ ，

原因可能是去除了细胞壁的原生质体在诱变过程中能直接与诱变剂接触，诱变剂迅速内渗并与细胞核中DNA分子作用；另一原因是用于制备原生质体的细胞通常都处于对数生长期，代谢旺盛，复制频繁，生活力强，对诱变剂的敏感性高[8]。再生培养基中加入普那霉素与不加普那霉素相比，前者筛选得到的菌株平均产量是后者的112。5％ ，原因可能是普那霉素抗性变株能够解除普那霉素对普那霉素生物合成的反馈调节作用。最后得到1株始旋链霉菌抗性突变株ZP-07的摇瓶发酵产量达到1．59g／L，较出发菌株始旋链霉菌11-2提高101.3%。

2．5 突变株始旋链霉菌ZP-07的遗传稳定性

用群体传代的方法考察普那霉素高产突变株始旋链霉菌ZP-07的斜面传代稳定性。连续传代5次，经摇瓶发酵测其普那霉素浓度，结果见表2。

表2显示突变株始旋链霉菌ZP-07经5次传代后，普那霉素产量变化率仅为4．9％ ，表明其高产遗传特性较稳定。

2．6 突变株始旋链霉菌ZP-07形态特征

高产突变株始旋链霉菌ZP-07与出发菌株始旋链霉菌11-2的单孢子悬液适当稀释后涂布于斜面平板上，培养7~8d后观察其菌落形态，结果见表3。

2．7 突变株始旋链霉菌ZP-07的生化特性

将突变株始旋链霉菌ZP-07在3L发酵罐上进行发酵试验，定时取样，分别测定氨基氮、普那霉素浓度、pH、菌丝浓度、还原糖浓度及DO值，绘制曲线(图7)。

从图7可以看出，突变株始旋链霉菌ZP一07的延迟期为0～24h，在此时间段内，pH变化较大，溶氧降低；对数生长期为24～50h，时间段内菌体快速生长，糖氮消耗的较快；之后是稳定期和衰亡期，菌体增长减缓，并开始减少，此时pH有所增加。普那霉素在21h时开始产生，之后浓度快速增大，在72h左右达到最大值，之后开始降低。

参考文献

[1]Cocito C．Antibiotics of the virginiamycin family，inhibitor which contain synergistic

components[J]．Microbiol Rev，1979，43：145

[2]Chant C，Rybak M J．Quinupristin／dalfopristin(RP59500)：a new stmptogramin antibiotic [J]．Ann Pharmacother，1 995，29(10)：1022

[3]金志华，吴亚铭，金一平，等．普那霉素产生菌的推理育种[J]．中国抗生素杂志，2004，29(5)：275

[4]李祥锴，安志东，朱非．林肯链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究[J]．氨基酸和生物资源，2001，23(4)：24

[5]陈钧呜，徐玲娣编．抗生素工业分析[M]．北京：中国医药科技出版社。1991：109

[6]Preud’homme J，Tarridec P，Belloc A．Pristinamycine：isolement，caracterisat ion et identification des constiuants[J]．Boll Soc Chim，1968，2：586

[7]贺筱蓉，黄小倩．链霉菌原生质体的制备[J]．生物学通报，1998，33(1)：40

[8]施巧琴，吴松刚．工业微生物育种学(第二版)[M]．科学出版社，2003：292；302；303

复合诱变筛选avermectins高产菌株

浙江海正药业股份有限公司， 台州318000)

摘要： 由Streptomyces avermitilis初始菌株经过自然分离可以得到三种不同类型的菌株，即灰色粉末型、白色和光秃型。其中灰色粉末型产素水平最高，摇瓶发酵效价达到6835.1μg／ml，B1组分达到56.3%。经过紫外线和亚硝基胍对初始菌株的孢子的诱变及对其原生质体的诱变再生，并且经过异亮氨酸和链霉素的定向筛选，得到的高产菌株摇瓶发酵效价达到8542.9μg／ml，B1组分达到64.9%；同时通过对高产菌株进行传代培养检验其传代稳定性，结果表明，传代3代后，菌株开始退化，并且其发酵效价有比较显著的下降。

关键词： 阿维链霉菌； 定向选育； 原生质体诱变及再生

Screening of high-yield avermectins producing strain by complex mutation

Zhejiang Haisun Pharmaceutical Co．Ltd．， Talzhou 318000)

ABSTRACT Three types of colony，powdery gray，white and bald，were naturally isolated from Streptomyces avermitilis initial strain．Among them，the powdery grey one produces the highest level of avermectins，and its total titer reaches 6835.1μg /ml in shaking flask with B1 component

accounting for 56.3%. After mutated with UV and NTG on spores and protoplast(mutated protoplast need to be regenerated before selection)，then induced and selected by Ile and Streptomycin，an avermectins high-yielding strain was selected with total titer 8542.9μg／ml and Bl component

64.9%．The stability of the high-yielding mutant was tested，the result showed that after passing 3 generations，the strain began to retrogress and the total titer had a substantial decline．

KEY WORDS Streptomyces avermitilis； Directed screening； Protoplast mutagenesis and regeneration

1976年，美国Merck公司的研究人员从日本提供的一株阿维链霉菌(Streptomyces

avermitilis)MA-4680的发酵液中获得一族结构相似的16元环大环内酯类新型抗生素，定名为

avermectins(AVMs)。它们是四对八个同系物，即avermectin A1a／Alb、B1a／B1b、A2a／A2b 、B2a／B2b，它们经过催化剂氢化生成的还原产物含8O%以上22，23-双氢avermectin B1a，2O％ 以下22，23-双氢avermectin B1b 的混合物的非专利商品名称为依维菌素(ivermectin)。虽然AVMs既没有抗细菌也没有抗真菌的活性，但随后的研究表明，它们是迄今为止发现的最为有效的杀虫剂、杀螨剂和杀昆虫剂之一，对防治人、畜及农林业的多种螨虫、昆虫和寄生虫危害有着重要的意义。

本文利用紫外线和亚硝基胍对孢子诱变及对诱变原生质体再生，并且经过异亮氨酸和链霉素的定向筛选，得到的高产菌株摇瓶发酵效价为初始菌株发酵效价的1．25倍。同时从菌株发酵产物的HPIC图谱可以知道没有导致产生高组分杂质的突变。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

Streptomyces avermitilis由浙江海正制药有限公司菌种保藏中心提供。

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 斜面培养基(%) 玉米淀粉2.0，酵母粉0.2，K2HPO4 0．05，CoC12·6H2O 0.0005，MgSO4·7H2O 0.01，MnSO4·7H2O 0.005，琼脂2.5g，pH7.2～7.4。

蒸馏水配制。置于灭菌锅内在0.11MPa，121℃消毒20min。

1.2.2 种子培养基(%) 葡萄糖0.5，玉米淀粉2.0，黄豆饼粉1.0，酵母粉0.6，酵母膏0.08，α-淀粉酶0.03，玉米浆0.003，花生饼粉0.005，CoC12·6H2O 0.0005，pH7.2。自来水配制，分装40ml／250ml三角瓶。置灭菌锅内，在0.11MPa，121℃消毒20min。种子的培养条件为27℃。

1.2.3 发酵培养基(%) 玉米淀粉5.0，NaC1 0.2，K2HPO4 0.05，CoC12·6H2O 0.0005，MgSO4·7H2O 0.01，MnSO4·7H2O 0.005，ZnSO4·7H2O 0.005，FeSO4·7H2O 0.005，pH7.0，蒸馏水配制，分装40ml／250ml三角瓶。以上培养基0.11MPa，121℃灭菌柜蒸汽灭菌30min。摇瓶发酵培养条件为28℃，摇床转速220r／min，偏心距5cm。

1.2.4 原生质体制备及再生培养基[1]

菌丝培养基(%) 蔗糖1.0，葡萄糖0.2，蛋白胨0.6，NaC1 0.4，KH2PO4 0.03，MgSO4·7H2O 0.02，MnSO4·7H2O 0.005，(NH4)2SO4 0.25，pH7.0，蒸馏水配制。

以上培养基0.11MPa，121℃灭菌柜蒸汽灭菌30min。

原生质体再生培养基(%) 蔗糖10.0，葡萄糖1.0，蛋白胨0.15，琼脂2.2，(NH4)SO4 0.15，MgC12·6H2O 1.0，CaCO3 0.3，pH7.2，蒸馏水配制。

微量元素溶液0.2%(V／V)，0.5% K2HPO4 1%(V／V)，0.25mol／L TES溶液10%(V／V)，分别灭菌后加入。0．07MPa蒸汽灭菌25min。

稳定液(%) 蔗糖10.0，MgC12·6H2O 2.0，蒸馏水配制。

微量元素溶液 0.2 (V／V)，25%K2SO4 0.4(V／V)，3.68 CaC12，10%(V／V)，0.25mol／L TES溶液10%(V／V)，分别灭菌后加入。0.07MPa蒸汽灭菌25min。

1.3 试剂

培养基 蛋白胨(Oxoid)，酵母粉、酵母膏(上海生工生物试剂公司)，琼脂(纯化，中国医药(集团)上海化学试剂公司)。

诱变筛选试剂 亚硝基胍(分析纯，Fluka Chemic AG，CH-9470 Buchsl瑞士包装)，溶菌酶(1ysozyme，Sigma公司，USA)，异亮氨酸、甘氨酸、顺丁烯二酸(分析纯，上海康达氨基酸厂)，链霉素(海正药业)。

HPLC试剂 无水甲醇、无水乙醇(色谱纯，Merck公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 单孢子悬液制备 向待处理的斜面中加入10ml无菌水，用接种环刮下孢子，玻璃珠震荡打碎，然后过滤得到单孢子悬液。

1.4.2 原生质体的制备 参照文献[1]。

1.4.3 原生质体的再生 将经过亚硝基胍(NTG)诱变、洗涤稀释后的原生质体涂布于原生质体再生培养基，28℃培养48h。

1．4．4 菌株诱变

紫外线(UV)诱变[2] 出发菌株孢子悬液的制备参照文献[3]进行。将孢子悬液用无菌生理

7盐水稀释至浓度约为10个／ml后，于28℃保温预培养8h。开启波长为253．7nm 的紫外灯预照

射20s，然后在直径为6cm 的无菌平皿中加入5ml孢子悬液和2枚无菌大头针，并放置于距紫外灯管30cm 的磁力搅拌器上，打开皿盖和启动磁力搅拌器进行紫外光应根据实验照射不同时间。照射完毕后用黑布包裹平皿，置28℃培养24h，在红灯下进行梯度稀释涂平皿，继续用黑布包裹，置28℃培养4d，计数各梯度平皿菌落数。

NTG诱变参照文献[2]。

1.4.5 筛选方法

筛选流程 出发菌株→单孢子悬液(或原生质体悬液) →诱变→稀释涂平皿→母斜面→初步筛选→子斜面→复筛→目的菌株

L-异亮氨酸诱导按文献[3]操作进行。因为avermectin A组份分子结构中C25位的2-丁基来自L-异亮氨酸，B组份分子结构中相应部位的异丙基是来自L-缬氨酸(L-Va1)，因此，从理论上说用L-异亮氨酸诱导可提高变异株产生有效组份B1a 的能力。

链霉素筛选按文献[4]进行。

1.4.6 avermectins含量测定

HPLC 条件色谱柱 Hypersil C18 (250mm ×4.6mm，5μm)；流动相：CH3OH ：H2O=90：10；

流速：1.0ml／min；检测波长：246nm；柱温：25℃；进样量：20μ1；B1a标准品由浙江海正制药有限公司提供。

分析方法 根据不同发酵时间来判断效价从而确定合适发酵液的稀释倍数，在预期发酵效价低于1500μg／ml时可以采用lO／3倍，也就是3ml发酵液与7ml乙醇共置于具塞带有刻度的10ml试管中，混合摇匀后超声处理30min，然后过滤取上清液246nm波长下做HPLC曲线。当预期效价高于1500μg／ml采用10倍稀释，其它操作同上。

绘制标准曲线 用乙醇配置一系列梯度浓度的avermectin B1a标准溶液(0～6000μg／ml)，分别注入色谱工作站并且测定各溶液的吸收峰面积，对浓度(Y)和峰(X )的面积之间的关系进行一元线性回归，得到的回归曲线方成为：

Y=0.0005632X-3.4671 R-0.9999

1.4.7 单菌落效价测定 挑取28℃培养8d的单菌落，加入10ml丙酮，超声波处理20min后效价测定按1.4.6进行，然后将测得的丙酮浸提液效价(mg／L )乘以10，即得到单菌落效价。 2 结果与讨论

2.1 菌落特征与产素能力的关系

对出发菌株进行自然分离时三种菌落形态的摇瓶发酵后的avermectins产量及B组分所占的比例如Tab．1所示。

Tab.1 The relationship between colonial morphology and avermectins producing capability

Total titer (μg／ml) Colonial

mprphology ＜4500 4500~5500 5500~6500 6500~7500 ＞7500

1 9 18 35 13 Powdery grey

White 4 6 19 24 15 Bald 7 10 7 3 0

从Tab.1可以看出，出发菌株的菌落形态主要有三种类型，并且以灰色粉末型和白色粉末型为主要的菌落形态。比较它们的生产能力可以发现灰色粉末型最强，而且高产菌落的比例也最高；白色粉末型次之，光秃型产量最低。所以，后面实验中菌株筛选是以灰色粉末型为主。

2.2 选择合适的诱变剂

2.2.1 紫外线(UV)诱变 在实验中照射时间分别选择为0、15、30、45、60、75s。选取灰色粉末型菌落的孢子进行紫外线诱变处理。实验结果表明，该菌株对紫外线十分敏感，作用时间超过60s后，致死率几乎达到100％，这与一般链霉菌的差异较大。同时可以发现接近45s菌株的致死率为90%，在这个致死率下取得好的诱变效果的几率比较大，所以后面的实验中选择照射时间为45s。

2.2.2 亚硝基胍(NTG)诱变 通过实验确定了合适的诱变pH[5]、诱变时间和诱变剂量。实验结果表明，综合致死率、正变率、负变率和高产菌株的比例等几个因素，当NTG的浓度为1.0mg/ml、pH为6.0的缓冲液诱变45~60min为比较合适的诱变条件。

2.2.3 紫外线(UV)与亚硝基胍(NTG)复合诱变

根据上面的实验结果，我们设计了先用紫外线，然后用亚硝基胍进行复合诱变的方法。实验结果表明，紫外灯30W，照射时间45s；亚硝基胍浓度1.0mg／ml，pH6.0，诱变时间45min为合适的诱变条件；结果还表明，复合诱变剂处理 Streptomyces avermitilis 后的效果要稍好于单一的诱变剂，可以复合诱变出高于130％的菌株。

2.2.4 原生质体诱变及再生 原生质体没有细胞壁，所以对诱变剂更加敏感，在用NTG诱变原生质体时的诱变条件改为：NTG 浓度1.0mg／ml，诱变时间15min，pH6.0，其他操作不变。实验结果表明，原生质体诱变和再生后菌株正变率和产量正变幅度都有较大的提高，诱变和再生的正变率分别为自然分离的对照菌株的1.37和2.27倍，产量正变幅度分别高于30%和40%。因此利用原生质体诱变和再生技术对 Streptomyces avermitilis 进行菌种选育是一种有效的方法。

2．3 筛选结果

Fig.1和Fig. 2是分别以L-异亮氨酸(L-isoleucine，Ile)为诱导筛选介质和以链霉素为选择压力的筛选结果。当L-异亮氨酸的浓度为0.06%时得到较好的筛结果。

由Fig.1可以看出，经过Ile筛选得到的菌株的B1a组分的生产能力比自然分离和诱变得到的菌株高，比较经过Ile筛选的孢子和再生后的原生质体的筛选结果可以看出，两者B1a组分的生产能力分别为自然分离的1.37倍和1.28倍。所以Ile对提高B1a组分的效果还是很明显的。

由Fig.2可以看出，各种诱变筛选组合方法都可以不同程度地提高avermectin的产量，以NTG(原生质体再生)+链霉素(SM)的效果最好，该方法得到的高产菌株avermectin的生产能力是

2.4.1 菌种选育谱 对出发菌株进行选育的系谱如Fig.3所示。

2.4.2 菌株Av-6传代稳定性 将所得的菌株Av-6连续传代5次，所得的各子斜面进行摇瓶发酵，考察其总的效价和B1a组分的稳定性，实验结果如Tab.2所示。

从Tab．2可以看出，目的菌株经过5代无论是总的发酵效价还是B1a组分都有所下降，但B1a组分占总组分的比例没有大的变化，另外可以发现传3代时表中三个指标基本稳定，所以可以3代为时间标准来进行菌株的复筛和复壮。

2.4.3 高产菌株Av-6发酵产物的HPLC图谱 高产菌株的发酵效价由6835.1μg／ml上升到

8542.9μg／ml，组分由56.3%上升到64.9%。由Fig.4还看出在诱变过程中菌株没有导致产生高组分的突变。

2.5 讨论

上面的实验说明所用的紫外线和亚硝基胍的诱变筛选方法还是有效的，尤其是使用了原生质体诱变及再生和异亮氨酸诱导的方法，筛选到的目的菌株无论是总的效价还是B1a组分都比初始菌株有较大的提高。

阿维链霉菌存在着比较严重的自然退化现象，目的菌株经过5代无论是总的发酵效价还是B1a组分都有所下降，但是B1a组分占总组分的比例没有大的变化，另外可以发现传代3代时以上三个指标基本稳定，所以可以3代为时间标准来进行菌株的复筛和复壮。

Fig．4 The chromatogram of high—yielding strain

参考文献

[1]Baltz H R．Genetic recombination in Streptomyces fradiaeby protoplast fusion and cell regeneration[J]．J Gen Microbiol，1978，107(1)：93

[2]刘颐屏．抗生素菌种选育的理论和技术[M]．北京：中国医药科技出版社，1992：31

[3]邓子新，唐纪良译．链霉菌遗传操作实验手册[M]．长沙：湖南科学技术出版社，1988：1

[4]陶纯长，谌颉，郭美锦，等．链霉素抗性突变理性筛选avermectin高产菌株[J]．中国抗生素杂志．2002．27(9)：521

[5] Delic V，Hopwood D A，Friend E．Mutagenesis by Nmethyl-N-Nitro-N-Nitr0s0guanidine (NTG ) in Streptomyces coelicolor[J]．Mutat Res，1970.9(2)：167