药物SRB法实验步骤
药物SRB 法实验步骤(根据原方案)
SRB （黄酰罗丹明B ）比色分析
1.1%乙酸：量取2ml 乙酸，定容到200ml 。4℃保存
2.0.4%SRB
200ML ：称取0.8gSRB ，溶于200ml 乙酸中。室温保存。
3.1 %TCA（三氯乙酸MV163.39）
250ML:称取2.5gTCA 加水定容至250ml ，4℃棕色瓶或锡纸避光保存。
4．50%TCA
100ml ：称取50gTCA ，加入水定容至100ml 。4℃棕色瓶或锡纸避光保存
5.10mM unbuffered Trisbase(PH10.5)
500ML:称取0.6057g Trisbase（三羟甲基氨基甲烷MV121.14）加水定容至500ml4℃保存
1青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚的配制
青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚采用DMSO 溶解，使用终浓度皆为0、3、10、30、100、300μg/ml。阴性对照为1%的DMSO 溶液。
青蒿素 55mg/400ul 137.5μg/ ul 分子量：282.33 蒿甲醚 51mg/600ul 83.33 μg/ ul 分子量：298.37 双氢青蒿素 30mg/ml 30μg/ ul 分子量：284.35 青蒿琥酯 120Mm 46.13μg/ ul 分子量：384.42 青蒿琥酯 50mg/200ul 250μg/ ul
将每种药稀释成30μg/ ul：
a ． 取30ul 137.5μg/ ul的青蒿素，加107.5ul 的DMSO
b ．取30ul 83.33 μg/ ul的蒿甲醚，加53.33ul 的DMSO
c ． 取30ul 46.13 μg/ ul的青蒿琥酯，加16.13ul 的DMSO
药物终浓度（μg/ ul） 0 3 10 30 100 每孔药物体积（ul ） 0 0.02 0.0667 0.2 0.667 5孔药物体积（ul ） 0 0.1 0.333 1 3.33 补的DMSO 体积(ul) 10 9.9 9.667 9 6.67 备注：上述的药物为稀释成30μg/ ul的药物。
取12个EP 管，每个加入（200ul*5）的应用液，按上述表格加入对应的药物和DMSO
⒉ 接种细胞
细胞传代至对数生长期后，经胰酶-EDTA 液消化，调终浓度为5×10 4 /ml，接种于96孔板中，每孔200μl 。，（边缘孔用无菌PBS 填充），5%CO2，37℃孵育。
⒊ 培养细胞
24h 后（至细胞单层铺满孔底（96孔平底板））, 弃去板上各孔内原有液体，再分别换上含有相应浓度药物的细胞培养液，于37℃，5%CO 2 培养箱中培养; 300 2 10 0
各种药物每浓度设5个平行孔。
⒉ SRB 用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束（48h ）后用三氯醋酸（TCA ）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul （终浓度为10%）固定；加TCA 时必须轻轻加在培养液表面，先静置5 min然后再将平板移至4℃放置1 h，这样细胞固定在培养孔的底部。
⒊ 倒掉固定液，小孔用灭菌三蒸水洗5遍，甩干，空气干燥。
⒋ 每孔加入0.4% SRB溶液100μl ，避光，在室温放置10 min。未与蛋白结合的SRB 用1% TCA液洗5遍，空气干燥。
⒌ 结合的SRB 用150ul 10 mmol/l非缓冲Tris 碱液（pH10.5）溶解，放在微量振荡器上5 min，避光。
⒍ 在酶联免疫检测仪测定OD 值，用空白对照调零，在波长为490 nm 处测定每个小孔的OD 值。将所获肿瘤细胞生长抑制率定义为药物对肿瘤细胞的体外抑制率。
抑制率=（无药细胞对照孔OD 值-用药孔OD 值）/无药细胞对照孔OD 值×100%