毕业论文_蛋清溶菌酶的研究 精品

1 前言

1.1 溶菌酶

溶菌酶(Lysozyme, EC) 又称细胞壁溶解酶（Muramidase ）是一种细胞非特异性免疫蛋白，是由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在 1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。广泛存在于生物体的体液和组织液中，包括植物汁液、动物分泌液、人的眼泪、唾液、乳汁、禽蛋及部分细菌中。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为 0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。它是一种作用于微生物细胞壁的胞壁质水解酶，根据作用的微生物的种类不同，可分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。根据作用位点不同，细菌细胞壁溶菌酶可分为：水解肽聚糖主链的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡糖胺之间 β-1, 4 糖苷键的胞壁质酶作用于肽聚糖侧链酰胺键的酰胺酶，和作用于肽链尾端的内肽酶，具体见图 1-1。根据来源不同可分为：T4 噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和动物溶菌酶，其中动物溶菌酶又细分为：

C 型(chicken-lysozyme type)、G 型(goose-type)和 I 型(invertebrate-type)溶菌酶。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。本文中选取来源于鸡蛋清中的溶菌酶即 C 型溶菌酶。

图 1-1 胞壁质水解酶的类型及其水解位点

Fig 1-1 Types of Murein hydrolases and their catalytic sites on peptide.

1.1.1鸡蛋清溶菌酶的物理化学性质

鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶，可分解溶壁小球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌基本上不起作用。当有EDTA 存在时，某些革兰氏阴性菌也可以被该酶分解。

鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之

一。此酶为白色、无臭结晶粉末 ,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的 3.4%~3.5%，由 18 种 129 个氨基酸残基组成，分子量为 14.4 kDa ，等电点为 11.1，最适温度为 50 ℃，最适 pH 值为 6~7，其化学性质非常稳定，在 pH1.2~11.3 范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也比较稳定，在 pH4~7、100 ℃处理 1 min 后活性基本不变，是一种稳定的碱性蛋白质，但在碱性条件下热稳定性较差。

1.1.2蛋清溶菌酶的结构和功能

蛋清溶菌酶的构象比较复杂，α-螺旋仅占 25%，同时存在着伸展的 β-片层结构，其分子是由 129 个氨基酸残基排列构成的单一肽链，溶菌酶的分子结构见图 1-2。

图 1-2 溶菌酶的分子结构示意图

Figure 1-2 Molecule structure of Lysozyme.

它具有 4 对二硫键(6Cys–127Cys, 30Cys–115Cys, 64Cys–80Cys 和 76Cys–94Cys) ，这几对二硫键在经变性剂或热处理后均能保持稳定，但是很容易被还原剂破

坏溶菌酶的活性位点为 35 位的谷氨酸(Glu35)和 52 位的天冬氨酸(Asp52)。一般认为蛋清溶菌酶具有胞壁质酶活性，即通过活性中心 Glu35 和 Asp52 的作用，催化水解 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡萄糖胺之间的 β-1, 4 糖苷键。Glu35 作为糖苷键的质子供体，剪切底物的 C-O-C 键，Asp52 处在一个明显的极性环境中，参与生成糖基酶中间体，然后与水分子发生反应，水解生成产物。溶菌酶通过此胞壁质酶活性，破坏细胞壁的肽聚糖，导致细菌细胞壁的逐渐瓦解，内容物外流，从而最终导致菌体死亡。

1.2溶菌酶的应用

1.2.1 溶菌酶在食品工业上的应用

①溶菌酶用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜

溶菌酶可作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。只要将一定浓度（通常为0.05%）的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐、保鲜的作用。

②用于新鲜海产品和水产品的保鲜

一些新鲜海产品和水产品在0.05%的溶菌酶和3%的食盐溶液中浸渍5min 后，沥去水分，进行常温或冷藏贮存，均可延长其贮存时间。

③在糕点和饮料上的应用

在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加入溶菌酶也可起到一定的防腐作用。在pH 值6.0~7.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶具有较好的防腐作用。

④在保健食品添加剂上的应用

溶菌酶是高盐基蛋白质，具有一定的保健作用；有抗感染及抗生素效力增强作用，有血液凝固和止血作用，有组织再生和形成促进作用等。

1.2.2 溶菌酶在生物工程上的应用

溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理革兰氏阳性细菌得到原生质

体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取。只要把对溶菌酶敏感的菌体悬液在适当缓冲液中用溶菌酶处理，再结合使用超声波、冷冻离心等手段，就可以得到无细胞提取液，进一步精制，可以得到所需菌体物质。因此，生物工业的发展对溶菌酶制剂的需求量将与日俱增。

1.2.3 溶菌酶在发酵工业上的应用

酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分。 它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。

此外，溶菌酶还可用于菌体内含物质的提取。将对溶菌酶敏感的菌体悬液在适当缓冲液中用溶菌酶处理，再结合使用超声波、冷冻离心等手段，就可以得到无细胞提取液，进一步精制，可得所需的菌体物质。

1.2.4 溶菌酶在医学上的应用

血清和尿液中的溶菌酶对一些疾病诊断是有帮助的，或者可以在疾病过程中作为一个标志性的物质。血清溶菌酶水平对白血病的诊断起到辅助性作用。在尿中，正常情况下只发现了少量溶菌酶，因此，测量尿中溶菌酶，对患有肾病的病人，特别是那些与肾病有关的肾小管功能障碍疾病的评价是有帮助的。此外，尿中的溶菌酶含量的变化有助于移植排斥、烧伤严重程度的判断，因为烧伤病人分泌的溶菌酶明显增多。角膜结膜炎干燥引起的泪腺退化不仅导致眼泪的减少，而且也降低了眼泪中溶菌酶的浓度。脑脊髓液中溶菌酶的增加被称为是炎症和中枢神经系统疾病的敏感信号。

1.2.5 溶菌酶在科学研究中的应用

由于溶菌酶具有能够专一性地分解细胞壁的能力, 除了在实际生产中的应用外, 溶菌酶更广泛地应用于科学研究中。 如利用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点, 了解微生物细胞壁的构造，分解细胞壁后制备原生质体，从而用于微生物育种以及微生物分类等学术研究的领域。

在环境污染日趋严重的当今世界，在倡导绿色食品的今天，溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，也不会在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。另外，由于人溶菌酶在参与机体的防御机制，在抗感染、抗肿瘤和免疫调节等方面的作用具有其他来源的溶菌酶无法比拟的优势，具有可观潜在的临床应用价值。因此，有关人溶菌酶的应用研究以及如何实现工业化生产已引起广泛重视。采用当前的基因工程技术，利用原核或真核生物作为寄主细胞，从而为实现大规模生产人溶菌酶提供了可行性途径，这必将把溶菌酶的研究利用推入一个崭新的阶段。

1.3 溶菌酶与细菌相互作用的研究进展

1.3.1细菌细胞壁结构

细胞壁是存在于原核细胞、真菌藻类、植物细胞外层的一道屏障。细胞壁可抵抗渗透压，保持细胞的完整性。根据革兰氏染色反应，可将细菌分为两类：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。它们的细胞壁组成不同。革兰氏阳性菌细胞壁仅由肽聚糖层构成，肽聚糖的层数较多，厚度约为 20~30 nm，且交联度高，并含有少量的磷壁酸，所以常用溶菌酶水解革兰氏阳性菌的细胞壁，从而获得原生质体。革兰氏阴性菌细胞壁分为内外两层(图 1-3)，即外层脂多糖层和内层肽聚糖层。

图 1-3 革兰氏阴性菌细胞壁

Fig.1-3 The cell wall of gram-negative bacteria