中国生物工程杂志

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（７）：４３～４９

条斑紫菜ＳＡＭＳ基因克隆与

生物信息学分析



易乐飞１　王　萍１　周向红１　刘楚吾２

（１淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室　连云港　２２２００５　２广东海洋大学水产学院　湛江　５２４０８８）

摘要　干旱、高盐和低温是限制植物生长和农作物产量的主要逆境因子。Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶（Ｓ??ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＳＡＭＳ）与植物抗逆境密切相关，而且超表达ＳＡＭＳ的转基因植物具有更高的抗干旱、高盐和低温能力。进行条斑紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶基因?（ＰｙＳＡＭＳ）ｃＤＮＡ的克隆及序列特征分析。首先利用电子克隆技术得到基因相关的ｃｏｎｔｉｇ，预测全长并设计引物，最后利用ＲＴＰＣＲ技术成功克隆了ＰｙＳＡＭＳ的ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＦＪ４０４７４８）。?该ｃＤＮＡ序列含有长１１５５ｎｔ的完整ＯＲＦ，编码蛋白（ＰｙＳＡＭＳ）分子量４１．８ｋＤａ，长３８４ＡＡ。ＰｙＳＡＭＳ与盘Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、莱茵衣藻（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ基网柄菌（

ｔｈａｌｉａｎａ）和水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）等多种生物的ＳＡＭＳ具有较高的序列一致性，含有与ＳＡＭＳ酶活性密切相关的氨基酸残基和保守序列，与人（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）和大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）的ＳＡＭＳ具有高度相似的三维结构。所以ＰｙＳＡＭＳ与其它生物的ＳＡＭＳ一样，在条斑紫菜的抗逆过程中发挥重要作用。研究ＰｙＳＡＭＳ有助于阐明条斑紫菜耐受非生物胁迫的作用机理，有助于获得高抗逆转基因植物。关键词　条斑紫菜　Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶　克隆　生物信息学?

中图分类号　Ｑ７８

　　干旱、高盐和低温是限制植物生长和农作物产量的主要逆境因子，克服干旱、高盐和低温对农业生产的制约，培育具有良好抗逆特性的作物品种，一直是各国科学

１］

。随着分子遗传育种的发展，利用抗逆家关注的焦点［

ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＳＡＭＳ，ＥＣ２．５．１．６）基因受多种非生物胁迫的诱导表达。例如甘薯（Ｉｐｏｍｏｅａ

３］

ｂａｔａｔｓ）ＳＡＭＳ基因受低温胁迫诱导表达［；大洋洲滨藜［４］（Ａｔｒｉｐｌｅｘｎｕｍｍｕｌａｒｉａ）和西红柿（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ［５，６］ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＭｉｌｌ．）的ＳＡＭＳ基因受到盐胁迫诱导表

基因对作物进行基因工程改良已成为作物育种的重要途

２］

。分离抗逆基因是基因工程改良的第径并且成效显著［

达；烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）的ＳＡＭＳ２基因受氧化胁

７］

迫、盐胁迫及高温胁迫诱导表达［；盐地碱蓬（Ｓｕａｅｄａ

一步。条斑紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）经过长期进化形成了适应极端环境的抗逆基因和生理生化机制。自然条件．５℃的低温下下，条斑紫菜叶状体生活在海水中；能在０正常生长，－２０℃冷藏长达数月后，下海仍能复活并正常生长；能耐受长达２至３天的缺水状态，即使被太阳晒干发脆，涨潮后仍能正常生活。因此充分挖掘条斑紫菜的抗逆基因对作物的基因工程改良意义重大。

　　研究表明，Ｓ?腺苷甲硫氨酸合成酶（Ｓ?

收稿日期：２００８１１２４　　修回日期：２００８１２１０

２００７ＢＡＤ２９Ｂ０３）、江苏省海洋生物技术重国家科技支撑计划（

２００８ＨＳ００４）资助项目点实验室开放课题（

电子信箱：ｌｉｕｃｗ＠ｇｄｏｕ．ｅｄｕ．ｃｎ通讯作者，

ｓａｌｓａ）ＳＡＭＳ基因受ＮａＣｌ、ＡＢＡ及干旱胁迫的诱导表

８］

达［；糜子（Ｐａｎｉｃｕｍｍｉｌｉａｃｅｕｍ）ＳＡＭＳ基因的表达涉及

糜子响应干旱胁迫及干旱后复水过程，可能是糜子抗

９］

。ＳＡＭＳ基因与植物对干旱、盐碱旱节水的关键基因［

和低温的抗性密切相关，并协助植物耐受非生物胁迫。ＳＡＭＳ催化ＡＴＰ和Ｌ甲硫氨酸合成Ｓ腺苷甲硫氨酸（Ｓ??

［１０］

ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＳＡＭ）。ＳＡＭ是生物体内重要?

的中间代谢物，参与多种生化反应，在医学上ＳＡＭ被用

１１，１２］来治疗关节炎、忧郁症和急、慢性肝炎［。ＳＡＭ在医

药工业上应用日益广泛，需求量也日趋增大，工业上越

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中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２９Ｎｏ．７２００９

１３］来越多地使用ＳＡＭＳ酶促转化法生产ＳＡＭ［。ｃＤＮＡ。ＰＣＲ反应体系为２５ｌ，其中含２．５ｌ１０×ＰＣＲ反μμ应缓冲液，１．７５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ，２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，上下游２引物各０．５μｍｏｌ／Ｌ，４ＵＴａｑＰｌｕｓＩ，１ｌＲＴ产物为模板。μＰＣＲ循环为：９５℃预变性３ｍｉｎ，然后３０个循环，每个循环９５℃变性６０ｓ，４８．７℃退火３０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，最后７２ｉｎ，４℃保存。反应后取１ｌ电泳。将℃充分延伸５ｍμＰＣＲ产物送上海生工进行测序。１．５　生物信息学分析

　　分析测序结果，推导ＯＲＦ及编码蛋白的氨基酸序　　目前已经在多种生物中克隆了ＳＡＭＳ基因，但尚无

１０］

ＡＭＳ基因（ＰｙＳＡＭＳ）的相关报道［；本文以条斑紫菜Ｓ

电子克隆技术为指导，用ＲＴＰＣＲ方法克隆了ＰｙＳＡＭＳ?的ｃＤＮＡ序列，并对其序列进行了分析。ＰｙＳＡＭＳ的克隆在理论上有助于阐明条斑紫菜抗干旱、高盐和低温等非生物胁迫的作用机制；在实践上有利于对作物进ＡＭ的工业生产提供新的备选酶行基因工程改良，为Ｓ源。为条斑紫菜功能基因的快速克隆以及进一步开发、利用条斑紫菜资源奠定基础。

１　材料与方法

１．１　材料和主要试剂

　　条斑紫菜叶状体取自连云港近海海域。Ｔｒｉｚｏｌ

ｒｅａｇｅｎｔ购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ

ＨＭｉｎｕｓＦｉｒｓｔ

ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒和ＬａｍｂｄａＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩＭａｒｋｅｒ３购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，ＴａｑＰｌｕｓＩ（Ｔａｑ＋Ｐｆｕ）和ｄＮＴＰ购于ＢｉｏＢａｓｉｃ公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，氯仿、异丙醇、ＤＥＰＣ、乙醇等其他常规试剂均为进口或国产分析纯。１．２　条斑紫菜叶状体总ＲＮＡ抽提

　　取１００ｍｇ组织，液氮研碎，加入１ｍｌＴｒｉｚｏｌ液裂解细胞，经氯仿抽提后用等体积的１∶１（Ｖ／Ｖ）的异丙醇和高盐溶液（１．２ｍｏｌ／Ｌ氯化钠＆０．８ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠）沉淀，７５％乙醇漂洗２遍后溶于无ＲＮａｓｅ水中。电泳和核酸蛋白定量仪检测ＲＮＡ的完整性、含量和纯度。－２０℃保存备用。

１．３　电子克隆（ｉｎｓｉｌｉｃｏｃｌｏｎｉｎｇ）与设计引物

　　以模式生物的ＳＡＭＳ的氨基酸序列作为查询序列，使用ｔ

Ｂｌａｓｔｎ检索ＧｅｎＢａｎｋ中条斑紫菜表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）数据库（ｄｂＥＳＴ）［１４］

。将检

索到的相似性高且含有ＳＡＭＳ保守序列的ＥＳＴ序列作为种子序列，接着用Ｂｌａｓｔｎ去检索条斑紫菜ｄｂＥＳＴ，将检索

到的Ｅ

ＳＴ序列用ＣＡＰ３程序组装和延伸［１４，１５］

。重复检索、延伸步骤直到不能延伸为止，最后得到ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ的ｃｏｎｔｉｇ。在ｃｏｎｔｉｇ的基础上，针对开放阅读框（ＯＲＦ）设计下列引物：上游引物５′ＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＴ３′，下游引物５′ＡＡＴＧＣＡＡＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡ３′。预计扩增片段长１

３６７ｂｐ，包含ＰｙＳＡＭＳ的完整ＯＲＦ。１．４　ＲＴ?

ＰＣＲ反应与测序　　取２μｇ总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，用ＭＢＩ的第一链ｃＤＮＡ合成试剂盒，按说明书的反应条件合成单链

列，利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ、ＤＡＳ?ＴＭｆｉｌｔｅｒ和ＰｒｏｔＳｃａｌｅ进行编码蛋白的各种基本理化特性、跨膜结构域和疏水性分

析［１６，１７］，用ＰＳＯＲＴ和ＴａｒｇｅｔＰ进行信号肽分析［１８，１９］

，以

编码蛋白为探针对ＧｅｎＢａｎｋ中的非冗余的蛋白质数据

库进行Ｂ

ｌａｓｔｐ分析［１４］

，使用ＣｌｕｓｔａｌＷ程序进行多序列比对［２０］

，ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ和ＣＤＤ进行功能结构域分析［２１，．２２］

，Ｓｗｉｓｓ?ｍｏｄｅｌ和ＵＣＳＦＣｈｉｍｅｒａ进行三维结构预测和三维比对［２３，２４］

，进而判断该蛋白是否为新序列以

及推导蛋白功能。

２　结　果

２．１　ＰｙＳＡＭＳ的电子克隆

　　以拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）ＳＡＭＳ序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿１９２０９４）作为查询序列，在条斑紫菜的ｄ

ｂＥＳＴ中进行ｔＢｌａｓｔｎ，获得了１７条高度相似并且彼此重叠的ＥＳＴ序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＵ１８７７３１、ＡＵ１９６９５８、ＡＶ４３４４９８、ＡＵ１９４４２３、ＡＵ１９４１８２、ＡＵ１９１５２８、ＡＵ１９２７９２、ＡＵ１９３８９７、ＡＵ１９３９５２、ＡＶ４３２１３２、ＡＶ４３６１１６、ＡＶ４３１７７０、ＡＶ４３６３１１、ＡＵ１８７１０４、ＡＶ４３６３５１、ＡＶ４３５３６７、ＡＶ４３８０４１），最后拼接产生１条长１５７０ｂｐ的ｃｏｎｔｉｇ。２．２　ＲＴ?

ＰＣＲ与测序结果　　ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳分离后呈现一条长约１３７５ｂｐ的特异性条带，与预期的１３６７ｂｐ的扩增片段十分接近（图１）。测序获得了ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＦＪ４０４７４８）。ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ序列与电子克隆得到的ｃｏｎｔｉｇ序列比对结果表明两者不同的碱基仅８个，一致性为９９．３６％。ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ与ｃｏｎｔｉｇ的编码蛋白的比对结果显示两者氨基酸序列完全相同，一致性为１００％。如果将个体间多态性和ＥＳＴ固有的错误率等因素考虑进去，测序结果与电子克隆结果一致。

２．３　ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ序列的生物信息学分析

　　ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ程序在ＰｙＳＡＭＳｃＤＮＡ序列的第２５～

２００９，２９（７）

易乐飞等：条斑紫菜ＳＡＭＳ

基因克隆与生物信息学分析

４５

运，而保留在细胞质基质中，

直接与代谢底物相作用。

图１　ＰＣＲ扩增产物电泳

Ｆｉｇ．１　Ｇｅ１ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲｒｅｓｕｌｔ

１：ＰＣＲｒｅｓｕｌｔ；Ｍ：ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩＭａｒｋｅｒλ

１１７９ｎｔ处发现有一连续ＯＲＦ，第２５～２７ｎｔ处是该ｃＤＮＡ序列的第一个ＡＴＧ密码子，其下游的＋４位是Ｇ，上游－３位是Ａ，符合典型的ｋｏｚａｋ规则，再结合推导的氨基酸序列Ｎ端同源性比较结果，可以认定第一个ＡＴＧ是该基因的起始密码子

［２５］

图２　ＰｙＳＡＭＳ的疏水性预测结果

Ｆｉｇ．２　ＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆＰｙＳＡＭＳ

　　以ＰｙＳＡＭＳ为探针对ＧｅｎＢａｎｋ中的非冗余蛋白质数据库进行Ｂｌａｓｔｐ分析，结果发现盘基网柄菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、莱茵衣藻（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、拟南芥和水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）等多种生物的ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉＳＡＭＳ与其高度相似（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ），但在条斑紫菜的蛋白质数据库没有找到与之高度相似的序列。将上述生物的ＳＡＭＳ和ＰｙＳＡＭＳ进行多序列比对（图３，仅显示部分比对结果），并用ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）法构建系统?发生进化树（图４），结果表明在进化上ＰｙＳＡＭＳ与绿藻门莱茵衣藻的ＳＡＭＳ亲缘关系最近，与高等植物的亲缘关系次之，与细菌的亲缘关系最远，进化树反映出的亲缘关系与传统分类相符。ＰｙＳＡＭＳ与盘基网柄菌、莱茵衣藻、拟南芥和水稻的序列一致性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）分别为７０％、７０％、６７％和６８％；若考虑功能相似性氨基酸之Ａ＝Ｇ＝Ｐ＝Ｓ＝Ｔ、Ｈ＝Ｒ、Ｆ＝Ｗ＝Ｙ

和间的保守替换（

。因此克隆得到的ｃＤＮＡ序列

含有完整的ＯＲＦ，编码蛋白（ＰｙＳＡＭＳ）长３８４ＡＡ。ＰｙＳＡＭＳ分子量大小为４１．８ｋＤａ，其碱性氨基酸（Ｋ、Ｒ）、酸性氨基酸（Ｄ、Ｅ）、疏水性氨基酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）和极性氨基酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）含量分别为４４、５６、１３０和８１个，等电点为５．６。疏水性分析结果表明（图２），ＰｙＳＡＭＳ在第２０２位的Ｖａｌ亲水性最强（－２．３５６），第３１７位的Ｉｌｅ疏水性最强（１．７８９）；亲水性区域均匀分布在整个肽链中，且分值高，而疏水性区域较少，分值低，因此ＰｙＳＡＭＳ在一级结构上以亲水性为主。ＰｙＳＡＭＳ基因没有跨膜结构域，结果与疏水性分析相符合。信号肽分析表明ＰｙＳＡＭＳ不存在信号肽酶切位点，可以推断，ＰｙＳＡＭＳ在细胞质中合成后，不进行蛋白转

图３　Ｓ腺苷甲硫氨酸合成酶的多序列比对?

Ｆｉｇ．３　ＭｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＳＡｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ?

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Ｉ＝Ｌ＝Ｍ＝Ｖ），那么ＰｙＳＡＭＳ与它们的序列相似性分别为８４％、８４％、８０％和８０％。ＰｙＳＡＭＳ与其它生物的ＳＡＭＳ在蛋白质水平上表现较高的一致性，ＳＡＭＳ种间ＡＭＳ在进一致性随着种属关系的变远略有降低，说明Ｓ化上相对保守，

其功能对个体生存是十分必要的。

３　讨　论

　　ＳＡＭＳ催化合成的ＳＡＭ是生物体内重要的中间代ＡＭ在磷酸乙醇胺甲基转移酶谢物。Ｓ

（ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅＮｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）合成甜菜碱?

图４　不同生物ＳＡＭＳ的系统发生进化树Ｆｉｇ．４　Ｃｌａｄｏｇｒａｍｆｏｒｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ

ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉＰｏｆＳＡＭＳｐｒｏｔｅｉｎｓ

　　为了进一步揭示编码蛋白的功能，使用ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ和ＣＤＤ对其保守结构域进行了分析（图５）。结果显示编码蛋白第７～１０４位氨基酸序列属于ＳＡＭＳ的Ｎ端超家族，第１１７～２３９位属于ＳＡＭＳ的中心区超家族，第２４１～３７８位属于ＳＡＭＳ的Ｃ端超家族。第１２０～１３０位具有ＳＡＭＳ的特征１（保守序列为［ＧＮ］?［ＡＳ］?Ｇ?Ｄ?Ｑ?Ｇ?ｘ（３）?Ｇ?［ＦＹＨＧ］），第２６７～２７５位具有ＳＡＭＳ的特征２（保守序列为Ｇ?［ＧＡ］?Ｇ?［ＡＳＣ］?［ＦＹ］?Ｓ?ｘ?Ｋ?［ＤＥ］）。

　　三维结构显示（图６），ＰｙＳＡＭＳ的整体结构类似于人（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）和大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）的ＳＡＭＳ（ＰＤＢＩＤ分别为２ｐ０２Ａ和１ＸＲＡ）

［１０，２６］

。ＰｙＳＡＭＳ单体

由三个结构域构成：Ｎ端结构域（第１～１０和１３２～２３５位氨基酸残基）、中间结构域（１１～１０９和２３６～２６９）、Ｃ端结构域（１１０～１３１和２７０～３８４），这三个结构域形成拟３极对称结构，每个结构域中３或４个β折叠形成一个片层，长的α螺旋后面依次跟着一对反平行β折叠和一个α螺旋，α螺旋都位于β片层的同一面。

（ｂｅｔａｉｎｅ）的过程中提供甲基［４］

，甜菜碱被认为是最好

的渗透调节剂，除了参与细胞的渗透调节外，还具有在渗透胁迫条件下稳定生物大分子结构和功能的作

用［

２７］

。ＳＡＭ是生物合成乙烯（ｅｔｈｙｌｅｎｅ）和多胺（ｐｏｌｙａｍｉｎｅ）前体［８，２８］

，多胺与乙烯是植物体内广泛存

在并具有重要生理作用的两类生长调节物质，都参与了植物抵抗逆境（水分胁迫、温度胁迫、盐胁迫等）的反

应［

２９］

。ＳＡＭ也被用于合成木质素（ｌｉｇｎｉｎ），木质素在植物被病原物感染后产生和积累，细胞壁木质化作用的加强可阻止病原物对寄主的进一步侵染。所以ＳＡＭＳ在植物耐胁迫方面可能也发挥一定作用。最近的研究也表明，ＳＡＭＳ基因除了受多种非生物胁迫的诱导表达外，超表达ＳＡＭＳ还可以提高转基因植物的抗低

温、干旱和耐盐能力［３０］

。表明ＳＡＭＳ参与渗透胁迫信

号传导途径、渗透胁迫途径、ＡＢＡ信号途径等多个信号

途径，在植物的胁迫应答中发挥重要的作用［

３０］

。　　图３的比对结果显示许多与酶活性密切相关的氨

基酸残基在ＰｙＳＡＭＳ中高度保守。例如金属结合位点

中同Ｍｇ２＋结合的Ｄ２０和Ｄ２８２

（位置以条斑紫菜为准），

ＡＴＰ结合位点中的保守的Ｐ环基序（ｍｏｔｉｆＰ?ｌｏｏｐ）ＧＧＧＡＦＳＧＫＤ（２６９～２７７），以及特征性的六肽ＧＡＧＤＱＧ

（１２２～１２７）［３１，３２］。ＰｙＳＡＭＳ不仅包含了上述高度保守

的活性位点，而且还与其它物种的ＳＡＭＳ具有较高的氨基酸序列一致性和三维结构相似性（图６）。说明ＰｙＳＡＭＳ与其它物种的ＳＡＭＳ一样，在条斑紫菜的ＳＡＭ的生物合成过程中发挥重要作用，是细胞内影响生命活动的关键基因。

　　电子克隆技术以数学算法为手段，以计算机和互联网为工具，利用现有的ＥＳＴ和生物信息数据库，快速地获得新基因序列并分析其功能特征，为新基因的实验研究提供了重要指导，为进一步研究功能基因组学

与蛋白质组学提供线索和基础［３３］。目前已有利用电子克隆指导实验克隆的大量报道［３４～３９］。本文采用生物

信息学预测、ＲＴ?ＰＣＲ和测序获得了ＰｙＳＡＭＳ的ｃＤＮＡ序列，证实了在条斑紫菜中使用该方法是有效的。与传统基因克隆的繁杂、耗时、效率不高的过程相比，该方法更为快速、精确且适用性强。随着更多生物测序

２００９，２９（７）

易乐飞等：条斑紫菜ＳＡＭＳ

基因克隆与生物信息学分析

４７

图５　ＰｙＳＡＭＳ的结构域

Ｆｉｇ．５　ＦｕｎｉｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｓｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＰｙＳＡ

ＭＳ

ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１９９４，２５（２）：２１７～２２７

７］余涛，支立峰，彭论，等．烟草中一条新的Ｓ腺苷甲硫氨酸　［?

００４，合成酶基因的克隆及表达分析．武汉植物学研究，２图６　ＰｙＳＡＭＳ单体以及与人ＳＡＭＳ的空间结构比对Ｆｉｇ．６　ＴｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＰｙＳＡＭＳｍｏｎｏｍｅｒａｎｄ

ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎＰｙＳＡＭＳ

ａｎｄｈｕｍａｎＳＡＭＳ

（ａ）ＲｉｂｂｏｎｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅＰｙＳＡＭＳｍｏｎｏｍｅｒ（ｂ）ＯｖｅｒｌａｙｏｆｔｈｅＣα

ｔｒａｃｅｓｏｆｈｕｍａｎＳＡＭＳａｎｄＰｙＳＡＭＳｍｏｎｏｍｅｒｓ的开展以及各类数据库的不断完善，电子克隆技术必将成为海洋生物新基因克隆的重要手段。

参考文献

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，２００５，４６（３）：５０５～５１３　［５］Ｓａｎｃｈｅｚ?ａｇｕａｙｏＩ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ?

ｇａｌａｎＪＭ，ＧａｒｃｉａＲ，ｅｔａｌ．ＳａｌｔｓｔｒｅｓｓｅｎｈａｎｃｅｓｘｙｌｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳ?ａｄｅｎｏｓｙｌ?Ｌ?ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｉｎｌｉｇｎｉｆｙｉｎｇｔｉｓｓｕｅｓｏｆｔｏｍａｔｏｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔａ，２００４，２２０（２）：２７８～２８５

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ｔｏｒｏＪＡ，ＰａｒｄｏＪＭ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＳ?

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ＹｕＴ，ＺｈｉＬＦ，ＰｅｎｇＬ，ｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＷｕｈａｎＢｏｔａｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ

，２００４，２２（４）：２７７～２８３［８］ＭａＸ，ＷａｎｇＺ，ＱｉＹ，ｅｔａｌ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＳ?

ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＳｕａｅｄａｓａｌｓａａｎｄｉｔｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｕｎｄｅｒＮａＣｌｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００３，４５（１１）：１３５９～１３６５

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