高速逆流色谱分离同分异构体_陈理
2006年11月November 2006
色谱
Chinese Journal of Chromatography
Vo l. 24No. 6
570~573
高速逆流色谱分离同分异构体
陈 理1, 邓丽杰2, 陈 平2
(1. 杭州市药品检验所, 浙江杭州310014; 2. 浙江大学化学系, 浙江杭州310028)
摘要:应用高速逆流色谱法对同分异构体的分离纯化进行研究。实验结果表明, 以正己烷-乙酸乙酯-水(体积比为1 10 10) 为两相溶剂系统, 上相为固定相, 下相为流动相, 进行二次高速逆流色谱分离, 可从茶多酚中分离出g 级的儿茶素同分异构体 (-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EG CG) 和(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG) , 其高效液相色谱纯度均在98%以上。选择四氯化碳-氯仿-甲醇-水(体积比为7 3 7 3) 为溶剂系统, 下相为固定相, 上相为流动相, 经一次高速逆流色谱即可将药物中间体溴代苯胺同分异构体进行有效的分离。
关键词:高速逆流色谱法; 同分异构体; 儿茶素; 溴代苯胺; 分离中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2006) 06-0570-04 栏目类别:研究论文
Separation of Isomeric Compounds by High Speed
Countercurrent Chromatography
CH EN Li , DENG Lijie , CH EN Ping
1
2
2
(1. Institute for Drug Control of Hangzhou, Hangzhou 310014, China; 2. Department of Chemistr y, Zhejiang U niversity, Hang zhou 310028, China)
Abstract :H ig h speed countercur rent chromatog raphy (H SCCC ) w as successfully used fo r the separation and preparatio n of isomeric co mpo unds. The influence of various tw o -phase solv ent system s o n the r esolutio n of the natural catechin isomers o f (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) and (-)-g allocatechin g allate (GCG) fro m gr een tea polyphenols and the sy nthetic isomeric com -pounds of p ar a -, ortho -, meta -bro moanilline w as investig ated. The results indicated that the cat -echin isomers of (-)-EGCG and (-)-GCG can be isolated through tw o r uns o f preparative H SC -CC w ith tw o -phase so lvent system co mposed of n -hex ane -ethyl acetate -w ater (1 10 10in volume ratio) . T he upper org anic phase was used as stationar y phase and the low er aqueo us phase as mo -bile phase, w hile the m obile phase w as operated at a flow rate o f 3 5m L/min, and the apparatus rotated at 800r/min. H igh perform ance liquid chr omatogr aphic analysis of (-) -EGCG and (-)-GCG r evealed that the purity w as all over 98%. T he isomeric com pounds of p ara -, or tho -, meta -bro moaniline can also be effectively isolated through a single run o f prepar ative H SCCC w ith the mobile phase flo w r ate of 3 0mL/m in and the apparatus ro tation speed o f 800r/min by using tet -r achlorom ethane -chloroform -m ethano-l w ater (7 3 7 3in v olume ratio) as tw o -phase solvent sys -tem, w hile the low er phase w as selected as statio nary phase and the upper phase as mobile phase. Key words :high speed countercurrent chro matography (H SCCC) ; isom er ic co mpo unds; cate -chin; bromo aniline; separation
高速逆流色谱(H SCCC) 是目前国际上较为先进的现代色谱分离技术, 是由美国国立卫生院Ito 博士研发的新型色谱分离技术。它是基于运转螺旋管内两相溶剂的单向性流体动力学现象而获得高效率分离的色谱系统, 是一种连续的无需任何固体
收稿日期:2005-12-30
第一作者:陈 理, 女, 副主任药师, 主要从事药物分析研究.
通讯联系人:陈 平, 男, 博士, 教授, Tel:(0571) 88273283, E -mail:c224@zju. edu. cn.
[1]
支持物的高效、快速的液-液分配色谱分离技术[2]。与高效液相色谱(H PLC) 不同的是, 它不使用固相载体作固定相, 克服了固相载体带来的样品的不可
逆吸附、污染、失活和变性等缺点, 分离量大, 样品无损失, 回收率高, 而且节约溶剂, 分离结果能达到相
当高的纯度; 不仅适用于非极性化合物的分离, 也适用于极性化合物的分离, 可广泛用于生物、医药、环保等领域中化学或生物活性物质的分离和纯化[3-9]。
随着当前生物医药等研究领域的迅猛发展, 越来越多的天然产物, 包括对一些具有高附加值的天然活性分子的提取分离以及精细化学品的合成过程中, 特别是药物中间体的合成过程中有效成分的分离, 都需要建立快速、高效的现代分离技术方法, 而高速逆流色谱法对于加强上述领域的药物开发支持体系提供了一条崭新的途径。由于同分异构体在理化性质上的相似性, 通常很难将其有效地分离, 因此研究同分异构体的分离方法就显得十分重要。本实验分别以茶多酚中的天然活性分子儿茶素的同分异构体(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 和(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG) 以及重要的药物中间体对溴苯胺、邻溴苯胺和间溴苯胺同分异构体为典型例子, 应用高速逆流色谱法分离技术进行了分离, 取得了满意的结果。
部分收集器收集下相洗脱液, 根据谱峰收集样品。收集的样品经减压浓缩重新配制样品液, 重复从上述 用氮气将上相固定相推进螺旋管柱中 至 根据谱图收集样品 的操作, 进行二次H SCCC 分离。最后分别将含有目标组分的洗脱液减压浓缩, 用于H PLC 测定。
H PLC 检测条件:色谱柱为Zorbax Eclipse XDB -C18(Analytical, 150m m 4 6m m i. d. , 5 m, Agilent 公司) , 柱温20 , 流动相为(A) 2%乙酸水溶液-(B) 乙腈, 梯度洗脱程序:0→25m in, 流动相A 与B 的体积比由92 8线性变成85 15; 流速1 0m L/min, 检测波长280nm, 进样量20 L 。1. 2. 2 溴代苯胺异构体的分离和测定 溶剂系统组成为四氯化碳-氯仿-甲醇-水(体积比为7 3 7 3) , 下相为固定相, 上相为流动相。分别称取对溴苯胺、邻溴苯胺和间溴苯胺各1g , 在固定相和流动相各50mL 的两相混合溶剂中溶解均匀即得样品溶液。分离前, 用氮气将下相固定相注满螺旋管柱。启动H SCCC 主机, 螺旋管柱按顺时针方向转向, 转速为800r/m in, 由尾端向首端以3 0m L/min 的流速向柱中泵入上相流动相。当上相流动相从主机出口流出, 证明体系已经达到流体动力学平衡, 此时泵入样品溶液80mL 。进样后用上相流动相洗脱, 柱口流出物通过紫外检测器在254nm 波长下连续检测, 记录仪同步记录, 根据谱峰用自动部分收集器收集样品。最后分别将含有目标组分的洗脱液减压浓缩, 用于H PLC 测定。
H PLC 检测条件:色谱柱同儿茶素检测用色谱柱, 柱温25 , 流动相为0 3%H 3PO 4水溶液-乙腈(体积比为70 30) 混合溶液, 流速1 0m L/min, 检测波长254nm, 进样量20 L 。
1 实验部分
1. 1 试剂与仪器
正己烷、乙酸乙酯、四氯化碳、氯仿、甲醇、对溴苯胺、邻溴苯胺和间溴苯胺均为国产分析纯, 茶多酚
(EGCG 含量为52%)由浙江东方茶业科技有限公司提供。高效液相色谱中使用的甲醇、乙腈和乙酸为色谱纯, 水为重蒸水。对照品(-)-EGCG 和(-)-GCG(纯度均为98%)购自Sig ma 公司。
自制制备型高速逆流色谱仪(J -型, 聚四氟乙烯螺旋管柱体, 内径5 5mm , 柱容量1200mL) ; Ag-i lent 1100高效液相色谱仪(H PLC) 。1. 2 实验方法
1. 2. 1 儿茶素异构体EGCG 和GCG 的分离和测定 采用正己烷-乙酸乙酯-水(体积比为1 10 10) 为两相溶剂系统。首先配制上述体积比的两相溶剂系统, 将其充分混合后, 静置分层。取上相作为固定相, 下相作为流动相。用氮气将上相固定相推进螺旋管柱中, 待固定相充满后开始进样。样品溶液由15g 茶多酚和110m L 下相流动相配制, 即茶多酚在下相流动相中静置过夜, 然后超声溶解均匀、过滤即得样品溶液。启动H SCCC 主机, 螺旋管柱按顺时针方向转向, 调节转速为800r/min, 由首端向尾端洗脱, 以3 5m L/min 的流速直接向柱中先泵入样品溶液100m L, 然后泵入下相流动相进行洗脱。待流动相流出色谱分离柱时调整紫外检测器零点, 并在254nm 下连续检测, 记录仪同步记录, 用自动
2 结果与讨论
2. 1 儿茶素异构体EGC G 和GC G 的高速逆流色谱分离纯化
由于儿茶素中主要含有(-) -表没食子儿茶素(EGC) 、(-)-表儿茶素(EC) 、(-)-EGCG 、(-)-GCG 、(-)-表儿茶素没食子酸酯(ECG) 等多种儿茶素, 每一种儿茶素又有其同分异构体形式共存其中, 因此对天然茶多酚中的儿茶素进行分离具有一定的难度。图1为原料茶多酚的高效液相色谱谱图。因茶多酚中(-) -EGCG 的含量较高, 而(-)-GCG 的含量较低(约为6%), 因此应首先对茶多酚中的(-)-EGCG 和(-) -GCG 进行一次高速逆流色谱分离富集。实验分别考察了下列不同的两相溶剂系统:(1) 乙酸乙酯-水(体积比为1 1) 混合溶液; (2)
正己烷-乙酸乙酯-水(体积比为1 10 10) 混合溶液; (3) 正己烷-乙酸乙酯-水(体积比为1 6 6) 混合溶液; (4) 正己烷-乙酸乙酯-水(体积比为1 3 4) 混合溶液; (5) 正己烷-正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比为1 2 2 6) 混合溶液。实验结果表明, 上述溶剂系统中系统(5) 的分离效果最好, 但正丁醇沸点偏高, 而且分离时间太长; 系统(1) 和(2) 的分离效果较好, 但其中(1) 的固定相保留率偏低。在正己烷-乙酸乙酯-水的溶剂系统中, (-)-EGCG 和(-)-GCG 的分离度次序如下:系统(2) >系统(3) >系统(4) 。因此, 考虑到高速逆流色谱分离对溶剂系统的要求, 实验采用的溶剂系统为系统(2) , 用自动部分收集器收集洗脱液, 根据儿茶素对照品进行H PLC 跟踪测定, 以获得富含(-)-EGCG 和(-)-GCG 的部分。图2为茶多酚经一次高速逆流色谱分离后产物的H PLC 谱图。比较图1和图2可以看出, 经一次H SCCC 分离后, (-)-EGCG 和(-)-GCG 与茶多酚中的其他组分能达到有效的分离(见图3-a) 。采用相同的溶剂系统进行二次高速逆流色谱分离, 即可对其中的儿茶素同分异构体(-) -EGCG 和(-)-GCG 进行进一步的分离, 其高速逆流色谱分离谱图如图3-b 所示。这样, 经过二次分离, 即可得到高纯度的儿茶素单体(-) -EGCG 5 5g , (-)-GCG 0 6g, 其H PLC 纯度均在98%以上(见图4)
。
图3 EG CG 和GCG 的高速逆流色谱分离谱图
Fig. 3 H SCCC chromatograms of EG CG and GCG a. pu rified on ce by HS CCC; b. purified tw ice by H SCCC.
图1 茶多酚的HPLC 谱图
Fig. 1 HPLC chromatogram of tea polyphenols
图4 经二次HS CCC 分离后(a) (-) -EGCG 和
(b) (-) -G CG 的HPLC 分析谱图
Fig. 4 HPLC analyses of (a) (-)-EG CG and (b) (-) -GCG of separation through second run of HS CCC
2. 2 溴代苯胺异构体的高速逆流色谱分离 溴代苯胺及其衍生物是重要的医药、农药以及染料中间体, 在合成产品中, 往往会有难分离的同分异构体杂质共存其中, 影响后续工艺合成过程中产品的纯度。为此, 本实验以对溴苯胺、邻溴苯胺和间溴苯胺3种异构体为例, 应用高速逆流色谱法分离技术进行分离。在分离过程中, 由于样品在色谱柱内按各组分在固定相和流动相两相中的分配系数进
图2 茶多酚经一次HS CCC 分离后其产物的H PLC 谱图
Fig. 2 HPLC ch romatogram of product of the
first HS CCC
separation
行分配、传递, 各个组分依据它在两相中的分配系数的差异实现分离的目的, 因此各组分的分离取决于合适的分配系数, 而溶剂系统的选择则是获得合适的分配系数的关键。本实验考察了不同的两相溶剂
系统, 结果发现选择正丁醇-乙醇-水(体积比为4 1 4) 体系时, 两相系统分层时间较长; 采用正丁醇-丙酮-水(体积比为4 1 5) 体系时, 固定相的保留值太低; 当选择三氯甲烷-乙腈-甲醇-水(体积比为2 3 2 2) 和四氯化碳-氯仿-甲醇-水(体积比为2 2 3 1) 体系时, 发现3种同分异构体的分配系数太接近, 分
配效果不理想。最后, 选择四氯化碳-氯仿-甲醇-水(体积比为7 3 7 3) 为最佳溶剂系统, 对溴苯胺、邻
溴苯胺和间溴苯胺在固定相和流动相两相中的分配系数值分别为1 41, 1 05和0 70。从溴代苯胺异构体的高速逆流色谱分离谱图(图5-a) 和H PLC 谱图(图5-b) 可见,
三者获得了良好的分离效果。
图5 溴代苯胺异构体的色谱图
Fig. 5 Chromatograms of bromoaniline is omers a. HS CCC chromatogram; b. HPLC chr om atogram.
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3 结论
高速逆流色谱作为一种有效的新型分离技术成功地应用于儿茶素和溴代苯胺同分异构体物质的分离, 表明高速逆流色谱法在结构相近的天然活性组分以及精细化学品中间体的分离纯化方面的适用性。目前, 与其他色谱新技术相比, H SCCC 在技术应用方面还有待于完善和推广。但随着H SCCC 分离技术的日渐成熟, 相信其在天然药物提取、生物技术和化学制药等领域的应用将会越来越广泛, 在高效率分离中将会更好地发挥其独特的作用。参考文献:
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