中国医疗器械杂志

　2000年　　　　中国医疗器械杂志

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

24卷第5期ChineseJournalofMedicalInstrumentation・289・

文章编号:1000-6974(2000)05-0289-06

膜片钳技术(三)

细胞分泌活动的实时监测技术

张春光,瞿安连,康华光

华中科技大学生物物理与生物化学研究所,(湖北,武汉,430074)

　　提要　分泌活动是神经元和内分泌细胞进行化学通信的基本模式。各种研究细胞分泌活动的生物物理技术的发展极大地加深了人们对细胞分泌机制的了解。简要介绍三种新近发展起来的实时监测细胞分泌活动的生物物理技术。

　　提要　细胞分泌;实时监测技术;荧光成像显微镜技术;膜电容监测技术;电化学技术　　中图分类号:Q6-33　　　文献标识码:A

Real-timeTechniquesinMonitoringSecretionActivityinCells

ZHANGChun2guang,QUAn2lian,KANGHua2guang

HuazhongUniversityofScienceandTechnology

　　Abstract　Chemicalcommunicationforneuronsandendocrinecellsdependsontheirsecretionactivity.Developmentofvariety

ofbiophysicaltechniqueshavegreatlypromotedtheunderstandingofthemechanismofcellularsecretion.Herewewillintroducethreerecentlydevelopedbiophysicaltechniqueswhichhavebeenfrequentlyusedtomonitorsecretionactivityinreal-time.

　　Keywords　celluarsecretion,real-timemonitoringtechnique,fluorescentvideomicroscopy,membranecapaci2

tancetechnique,electrochemistrytechnique.

　　分泌活动是细胞的一项重要生理功能,是许多不同种类的细胞与其周围环境进行通信的重要方式。特别是在神经和内分泌系统中,它是神经元和内分泌细胞与其它组织细胞进行化学通信的基本模式,因此人们对揭示分泌的生物化学与生物物理机制很感兴趣。这直接导致了许多细胞分泌检测技术的出现。　　早期人们对细胞分泌机制的研究主要采用冰冻刻蚀电镜技术和普通光学显微镜技术,研究方法主要是非现场静态观察。近十年来,细胞分泌的监测技术得到了迅速的发展,尤其是各种实时监测技术的发展,极大地增加了人们对细胞分泌机制的了解。有关细胞分泌检测技术的内容很多,由于篇幅所限,下面就目前常用的三种细胞分泌实时检测技术的原理、方法、应用范围以及优缺点作简要介绍。1.荧光成像显微镜技术

　　在荧光显微镜技术出现之前,人们也曾用普通光学显微镜技术来监测含特大囊泡细胞的分泌过程。然而,普通光学显微镜的分辨率受到衍射极限限制,不能监测小囊泡细胞的分泌。近年来共聚焦荧光显微镜技术的发展使实时监测小囊泡细胞的分泌成为可能。　　根据激发光的特点,共聚焦荧光显微镜可分为普通共聚焦荧光显微镜、激光共聚焦荧光显微镜和多光子荧光显微镜[1](表1)。

表1　共聚焦荧光显微镜的分类和特点

荧光显微镜

类型普通荧光显微镜激光荧光显微镜多光子荧光显微镜

光　源单色光源,如氙灯普通激光器

ps或fs

检测器

CCD照相机

成像方式

CCD二维成像+Z轴扫描X-Y-Z

三维扫描CCD二维成像

CCD照相机

+Z轴扫描光电倍增管

三维扫描

X-Y-Z

光电倍增管

激光器

　　如图1a所示,在显微镜腔的中部有一个双束分离器(dichroicbeamsplitter)。激发光(excitationlight)以垂直于发射光的方向进入显微镜后被双光束分离器全部反射到标本上,由此产生的荧光即发射光(emissionlight)则能完全透过它进入检测器中。为了获得合格的激发光,从光源出来的光在进入显微镜之前必须经过严格的滤波、聚焦、延迟等处理。因此光路的设计和滤光片(filter)的选择是很关键的问题。同样,发射光在进入检测器之前也要经过严格滤波和聚焦处理。如表1所示,普通共聚焦荧光显微镜使用普通单色光源,因此其检测和成像装置普遍采用CCD照相机;普通激光共聚焦荧光显微镜以激光为光源,检测和成像装置采用CCD照相机或者多个光电倍增管(PMT)加X-Y扫描器(旋转反射镜);多光子荧光显微镜以皮秒(ps)或飞秒(fs)激光器为光源,检测和成像装置普遍采用多个光电倍增管加X-Y扫描头。在多光子荧光显微镜技术中,一个分子必须同时吸收两个或三个光子才能产生一个荧光光子。因此多光子荧光显微镜技术必须采用ps(10-12s)或fs(10-15s)激光器作

λ)在红外或近红外区,为光源,激发光波长(

而发射光波长(Ελ/n,n为吸收的光子数)在可见及近紫外区(图1b)

。

图1(b)多光子荧光显微镜机构示意图

　　用荧光显微镜技术进行观察的一个先决条件是被研究对象必须在受到激发后能发射荧光。如果分泌物或囊泡内物质本身具有荧光,就可用荧光显微镜对其胞吐分泌过程进行直接观察。5-HT就是这样的一种物质,它在肥大细胞中的胞吐过程可直接观察到。在RBL细胞的5-HT储库检测表明,三光子技术更适合于这方面的研究,因为它能量低,对细胞损伤小,能进行长时间观察[2]。　　然而在大多数情况下,囊泡本身是没有荧光的,必须用荧光染料或荧光探针对囊泡膜或囊泡内物质进行预先标记。目前在囊泡分泌研究中常用的荧光标记方法有以下几种:

　　(1)　免疫荧光标记[3]　该技术可用来定量分析与胞吐有关的形态变化和蛋白运动。例如,多巴胺β羟化酶(DBH)在嗜铬细胞分泌囊泡中是一种主要的膜蛋白,由于它在胞吐中会出现在细胞膜的表面,随着它与胞外液中荧光标记的DBH抗体的结合,就能观察到胞吐位点在细胞膜上的分布以及囊泡膜的回收过程。　　(2)　荧光染料标记[425]　有两种方法,一是使用能选择性地标记膜表面的荧光标记物,如styryldyeFM1-43和FM4-64。由于这种染料在水相中没有荧光,但是当它嵌入脂质膜后显示较强的荧光,因此,当细胞外液中存在此染料时,融合到胞浆上的囊泡膜会

图1(a)

激光扫描共聚焦荧光显微镜结构示意图

使细胞表面荧光增加,通过胞吞回收的囊泡因吞进此染料而被荧光标记(图2a)。因此利用此染料标记细胞后能够实时观察细胞的胞吐及胞吞过程。二是使用丫啶橙(acridineorange)负载嗜铬细胞。因它只在酸性环境中才有荧光,因此胞吐后囊泡荧光会消失。用全内反射显微镜跟踪囊泡的移动过程,就可实现对囊泡转运、停定、锚定和分泌的整个过程机制的研究

。

　　(3)　绿荧光蛋白(GFP)标记[627]　通过基因转染方法将GFP基因转入标本细胞中并使它在囊泡中特异性表达,用激光扫描共聚焦荧光显微镜特别是多光子荧光显微镜可监测囊泡的运动过程。例如将GFP基因与囊泡特异的蛋白基因(如嗜铬颗粒蛋白B、神经肽Y、phogrin或proinsulin基因)整合在一起并转入PC12细胞或胰岛INS-1β-细胞中进行表达,用激光扫描共聚焦显微镜或多光子显微镜就能够时间分辨地追踪分泌囊泡的转移、入坞和胞吐过程(图2b)　　用荧光成像显微镜技术监测细胞的分泌活动具有如下优点:①非侵入性检测,对细胞没有损伤;②由于使用动态成像检测技术,给人的感觉更直观、逼真。③通过长时间三维立体成像,不仅可观察囊泡从转运到与细胞膜融合的整个过程,还可观察囊泡的回收过程。④多光子技术,空间分辨率高,能进行长时间实时动态监测。缺点是:①不能检测囊泡中信息物质的化学性质和量子含量;②时间分辨率不够高,不能检测囊泡与细胞膜融合瞬间的动力学过程。2.细胞膜电容检测技术　　在全细胞记录模式下(具体方法见本讲座二),电极与细胞构成如图3所示的等效电路[10]。细胞膜在等效电路中相当于一个电容器(Cm)与一个电阻(Rm)并联。由于细胞

分泌的最后一步是囊泡膜与胞浆膜融合的过

图2a利用囊泡对FM1-43荧光染料的摄取能力来研究不同神经末梢的生理功能。(A1)FM1-43染色标记,(A2)FM1-43和TexasRed

双染色标记。

图2b激光扫描共聚焦荧光显微镜跟踪INS-1细胞中phogrin-eGFP标记囊泡的运动。(B1)外液中含3mMglucose,(B2)外液中含30mMglu2μm。上图为某一时刻囊泡所cose.图中标尺为2

处的空间位置,下图为囊泡的运动轨迹。

图3膜电容检测时细胞的等效电路图。RS、

Rm、Cm、Cp和Er分别代表串联电阻、膜

电阻、膜电容、电极电容和膜电位。

程。因此当分泌发生时细胞膜的表面积会增加。又由于细胞膜的电容大小正比于细胞膜的表面积(～1μF/cm2),因此囊泡与细胞膜的融合引起细胞膜电容的增加。　　目前,膜电容的监测普遍采用DC+正弦信号分析法[829]。如图4a所示,其具体方法是在外加保持电压上叠加正弦波激励电压(频率0.3-1.5kHZ,振幅10-25mV)。在正弦波激励电压的前后或中途可插入一个引起细胞分泌的刺激信号,如去极化、光解释放的钙离子和激动剂刺激等[10212](图4)。通过“相敏检测器”对由此产生的电流正弦波进行分析,就可估算出细胞膜电容的变化。由于采用软件法进行相角补偿,因此相角的设置很重要,必须通过预实验对相角的变化进行正确地估计。通常在膜电容记录之前通过电流放大器的内部等效电路对串联电导Gs(Rs的倒数)和慢电容Cslow(主要是膜电容Cm)进行自动补偿和估计。如果等效电路与实际细胞的电特性不相符合,也会使测量结果产生误差。比如对于有突起的神经元,其等效电路比图3更复杂。通常情况下串联电导Gs对膜电容的计算影响最大,因此在监测膜电容变化的同时要监测Gs的变化。只有当Gs变化很小时,所记录的膜电容变化才是可

Ω或远远大于Rs靠的。一般地,当Rm>1G

(～10MΩ)时,膜电位Er的变化对膜电容的估计影响很小,因此为了使Rm值最大通常将Er设置在零电流电位。　　现在,膜电容监测技术能够分辨单个囊泡与细胞膜融合引起的膜电容变化。对囊泡融合的时间分辨率达毫秒级。由于胞吐后囊泡膜的回收会导致膜电容的减少,因此采用毫秒事件分辨率的膜电容检测技术能提供囊泡膜从融合到回收整个过程的详细信息。近十年来,全膜电容检测技术在研究细胞胞吐和胞吞机制方面得到了越来越广泛的应用,取得了丰硕的研究成果。　　用膜片钳技术监测细胞分泌的优点是

:

(a)电压去极化刺激引起耳蜗内毛细胞膜电容增

加。正弦波刺激电压幅度为20mV,频率为1kHz,去极化电压为-50mV,钳制电压为-80mV

。

(b)光解笼型化合物DN-nitrophen释放的钙引起PC12细胞膜电容的增加

图4细胞分泌活动的膜电容监测。

①能定量监测细胞释放的囊泡总量;②不管是慢的还是快的释放过程,均可以用它来监测;③无论囊泡中的信息物质是什么,都可以用它来检测。缺点是:①不能排除胞吞对胞吐检测的影响;②不能分辨直径小于200nm的单个囊泡与细胞膜的融合过程;③等效电路中Rs和Rm的较大变化会影响膜电容的正确估算。由于离子通道激活后Rm与激活电压成非线性依赖关系,因此在离子通道激活期间无法正确估算膜电容的变化。3.电化学技术

　　用电化学技术监测细胞分泌的原理是:当电极尖端临近存在容易氧化的化学信使物质时,它们可通过扩散到达电极表面。这时如果在电极尖端施加一定的电压,这些信使物质就会在电极尖端释放出电子而发生氧化,电极可俘获释出的电子并在电路中产生一定的电流(图5a)。通过电流放大器和计算机就可监测电极上氧化电流的变化。由于

不同物质的氧化电位不同,因此电化学技术能在一定程度上鉴别细胞释放的信息物质的化学性质,具有一定的选择性。目前用电化学方法可检测的激素或递质有:儿茶酚胺、5-HT、胰岛素、组胺、NO以及含色氨酸或酪氨酸残基的多肽等

。

极尖端最好切成斜面以增大表面积。电极尖端表面的大小应该与细胞大小相近。在正常

的生理溶液中,微电极的时间常数为μs级。微电极的电流大小与电极尖端面积和实验类型有关,一般在pA到nA范围。因此,通常采用象膜片钳放大器那种具有低噪声的仪器来检测。

　　在分泌检测实验中,通常将碳纤微电极取代玻璃微电极安置在合适的三维微操纵器上,使微电极尽量靠近培养皿中的单个细胞(距离一般

(a)

电化学技术监测细胞分泌的示意图

定律,对恒电位检测时的单个分泌电流峰积分即可估算出每个囊泡中包含的递质分子数,即量子包装的大小。微电极电化学技术具有良好的时间和空间分辨率,最适合于单个细胞胞吐的高分辨检测[13215]。在牛的肾上腺髓质嗜铬细胞上的实验第一次显示微电极能够测量单个细胞的分泌。每个嗜铬细胞包含大约150fmol儿茶酚胺,分布在30,000

(b)用CFE检测到的由60mM高钾刺激诱发的

个囊泡中[15]。

　　电化学技术监测分泌的优点是:①时间分辨率高达ms级,能监测单个囊泡的释放以及囊泡中的递质含量;②能鉴别信息物质的化学性质;③对细胞无损伤,可进行长时间监测。其缺点是:①只能监测细胞局部释放的信息物质;②被监测物质必须在电极上容易释出或获得电子,因此不能直接监测ACh、Glutamate、GABA等递质的释放;③电

嗜铬细胞分泌的电流峰

图5细胞分泌活动的电化学检测

　　根据施加电压的波形,电化学技术可分为恒电位法和高速循环伏安法。在恒电位法中,电极电压保持恒定,而在高速循环伏安法中,电极电压以三角波形式周期性地扫描,扫描速率在800V/s以上。恒电位法的优点是它提供了敏锐的时间分辨率。但是,它不能提供有关被测物质化学性质的信息。在高速循环伏安法中,虽然时间分辨率较低,却能提供信息分子的化学信息。因此恒电位法和高速循环伏安法两种技术提供了互补的信息而且在单细胞胞吐中应该同时应用。　　在单细胞电化学实验中,微电极一般用

μm的碳纤维制作。它被包裹在半径2.5～5

拉制的玻璃毛细管或合适的绝缘材料中。电

极敏感头容易吸附污染物而使灵敏度下降,因此电极使用时间不能太长。4.小结

　细胞的分泌活动是神经和内分泌细胞与

其它组织细胞进行化学通信的基本模式。

●

　目前常用的细胞分泌实时检测技术主要有共聚焦荧光成像显微镜技术、膜电容检测

●

技术和电化学检测技术。用荧光成像显微镜

技术监测细胞的分泌活动的必要条件是囊泡必须能发射荧光。当囊泡本身没有荧光时,必须对囊泡进行荧光标记。标记方法有:免疫荧光标记、荧光染料标记和通过基因转染方法的GFP标记。

　分泌时囊泡与细胞膜的融合导致细胞膜表面积和膜电容的增加。细胞膜电容的检测通常采用DC+正弦电压信号分析法。一般

Ω时,主要考虑串联电地,当膜电阻Rm>1G

导Gs对膜电容的影响。　用电化学技术检测细胞分泌的必要条件是囊泡释放的物质必须容易在电极被氧化。

●●

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电化学检测通常采用恒电位技术,它具有很高的时间分辨率,对电流峰进行积分即可估算出囊泡中激素或递质的含量。　上述三种实时检测技术各有优缺点。三种技术的联合运用已成为一种发展趋势。例如膜电容监测技术检测的是整个细胞膜电容

●

的净变化,受胞吞的干扰;而电化学技术检测的是局部囊泡释放的递质的量,不受胞吞的影响;两者具有很强的互补性。

参　考　文　献

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