革兰氏染色法
革兰氏染色法
实验原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇或丙酮脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。 染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所应起的。 ①革兰氏阳性细菌的细胞壁 G+细菌细胞壁具有较厚(20-80nm)而致密的肽聚糖层,多达20层,占细胞壁成分的60%~90%,它同细胞膜的外层紧密相连(图2-9)。有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸(teichoic-acid),也称胞壁质(murein),它是甘油和核糖醇的聚合物,磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带负电荷,它在细胞表面能调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关,细胞生长中有自溶素(autolysins)酶类起作用,磷壁酸对自溶素有调节功能,阻止胞壁过度降解和壁溶。 如果细胞壁的肽聚糖层被消溶,G+细胞成为原生质体(protoplasts),细胞壁不复存在,而只存留细胞膜。除链球菌外,大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。 ②革兰氏阴性细菌的细胞壁 G—细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄(15~20nm)而结构较复杂,分外膜(outer
membrane)和肽聚糖层(2~3nm)(图2-10)。在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间,称为壁膜间隙(periplasmic space)。 外膜 G—细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同细胞质膜相同之处也是双层类脂,但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。 LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成,含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖)和二脱氧已糖。由于糖的种类不同,使各种G—细胞具有不同特性的LPS。核心多糖(core polysaccharide)的主要组分是酮脱氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO)。 外膜中还含有几种蛋白,如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用(porin),调控外界分子进入细胞;有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体;许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的,它的毒性组分常称为内毒素(endotoxins)。 肽聚糖层 G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄,在大肠杆菌和其它细菌中仅有单 层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。 壁膜间隙 G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙,一层薄的肽聚糖处于其间,肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽,肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12~15nm,呈胶胨态。其间含有三类蛋白质:水解酶,催化食物的初步降解;结合蛋白,启动物质转运过程;化学受体(chemoreceptors),在趋化性中起作用的蛋白。 实验步骤: 1、涂片:取清洁玻片一块,在玻片两端1/4处下面用记号笔分别标明S ,分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内(注意涂片切不可过于浓厚)。
2、干燥:将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。
3、固定:涂面朝上,通过微火2-3次,不可过热,以载玻片不烫手为宜。
4、染色:
(1)初染: 加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。
(2)媒染: 滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。
(3)脱色: 将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精 刚刚不出现紫色时为止,约20—30秒钟,立即用水冲净酒精。
(4)复染: 用番红液染1—2分钟,水洗。
(5)镜检: 干燥后,置油镜观察。
(6)记录: 革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。(以分散开的细菌的革兰
氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。)
(注意事项:革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。)
实验结果:
革兰氏阳性菌都呈紫色,革兰氏阴性菌都呈红色。