钢针和竹针针刺对长时间电刺激诱发的骨骼肌细胞膜电位变化的作用

　　摘要：目的：比较金属针与非金属针针刺对长时间电刺激诱发的骨骼肌细胞膜电位变化的影响。方法：取雄性蟾蜍半腱肌，分离出两束肌细胞（随机分为对照组和实验组），每束骨骼肌细胞数量在20个左右。采用细胞内微电极技术，记录长时间电刺激对骨骼肌细胞膜电位的作用。实验组在刺激结束后即刻给予不锈钢针或竹针斜刺。结果：长时间电刺激导致骨骼肌细胞的膜电位向去极化方向发展；不锈钢针和竹针针刺均具有促进长时间电刺激后骨骼肌细胞膜电位恢复的作用，二者作用无显著差异。结论：针刺对骨骼肌损伤的疗效与针的材质无关，只要取“阿是穴”斜刺，则可能取得良好的治疗效果。

　　关键词：针刺；骨骼肌细胞；膜电位；细胞内记录

　　中图分类号：G804.2

　　文献标识码：A

　　文章编号：1007—3612（2012）07—0045-04

　　针灸治疗骨骼肌损伤具有疗效明显、疗程短、安全、经济等特点，近年来也得到了广泛应用。针刺对骨骼肌的治疗作用机制研究也取得了一定的进展。关于针刺作用机制的研究主要有两种观点：其一是神经一体液论，认为针刺的作用是通过激发某些神经递质的释放，使舒血管神经的活动增强，或者是通过降低运动神经元的活动，从而解除肌肉痉挛，缓解肌肉疼痛。其二是外周机制论，认为针刺可以通过某些不依赖于神经体液的途径而直接影响损伤肌肉结构与功能的作用机制。研究证明，针刺促进延迟性肌肉结构变化的恢复作用与针刺后骨骼肌细胞膜内钙离子，钾离子浓度改变有关。

　　目前，用针刺治疗骨骼肌损伤均采用金属针，那么非金属针是否也能取得与金属针一样的治疗作用？

　　用金属针治疗是否存在着电场或磁场的作用？本研究采用微电极技术，首先对单个骨骼肌细胞进行细胞内记录，观察其膜电位在长时间电刺激后的变化；并选用不锈钢针和竹针分别对骨骼肌细胞进行针刺处理，观察金属针刺与非金属针刺对骨骼肌细胞膜电位变化的作用是否存在差异，从而探讨针刺治疗骨骼肌损伤是否与针的材质有关。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 蟾蜍，体重40～50g，雄性，取其半腱肌分离出两束肌细胞作为实验标本。

　　1.2 标本制备 按常规方法破坏蟾蜍的脑和脊髓，剪除躯干上部及内脏，剥去下肢皮肤，置于任氏液内；用钢针固定下肢，除去下肢大腿的缝匠肌，大收肌、大内直肌和小内直肌后，找到长腱肌肉一半腱肌。在尽量保持长腱情况下将半腱肌摘出，用针固定远心端的胫骨基端侧肌腱和近心端的坐骨侧肌腱于硅胶垫上。于解剖显微镜下，用钟表镊子剥去结缔组织及肌外衣，再剥掉表面几层肌细胞，直至剩下左右两束，每束约20个左右的肌细胞为止。将剩下的两束完整的、两边均附着在肌腱上的肌细胞束用针在肌腱处重新固定好，放置半小时后进行实验。

　　1.3 细胞内记录 实验随机选取其中一束肌细胞为对照肌，另一束为实验肌。采用细胞内微电极技术，记录骨骼肌细胞膜电位。微电极的尖端直径小于0.5μm，充灌3mmol/L氯化钾溶液，电极电阻10～15MΩ。主要仪器：MEZ-8201直流放大器；VC-10记忆示波器；SEN-7301电子刺激器（以上均为日本光电公司产品）；XC-603型微电极推进器、垂直式微电极拉制器和二道生理记录仪（国产）。电刺激参数：刺激强度2～4V，波宽50ms，时间45min，频率2Hz。实验组在刺激停止后即刻，采用微电极推进器将不锈钢针或竹针沿肌束方向斜推进入骨骼肌细胞束内进行针刺。两种针的直径相近，约为0.5mm。实验在室温（24℃）条件下进行。需要明确的是斜刺并非将针刺人肌纤维单个细胞内，因为两种针的直径远大于肌细胞。实验观察的是（有或无）斜刺的同一条肌束中，肌纤维的静息电位的变化；针刺前后记录的肌纤维也并非相同的纤维。但是由于实验中的其他条件（同一块肌肉、浴液温度、酸碱及离子环境等）控制都一样，各组静息电位的变化是源于处理方式（有无针刺及使用的是竹针还是不锈钢针）的不同。

　　1.4 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件进行数据统计分析。为了统计方便，去掉膜电位的负号，以绝对值表示，单位：mV（毫伏）。其绝对值变小即表示细胞的膜电位降低，向去极化方向发展。其绝对值变大即表示细胞的膜电位增高，向复极化方向发展。各组数据均以Mean±SD表示。

　　2 结果

　　2.1 骨骼肌细胞膜电位随时间的变化 实验开始后，随机选取两肌束中肌细胞进行静息膜电位记录，观察记录开始、静置任氏液内1h和2h后膜电位的变化。可见，在2h之内，膜电位没有显著变化（图1）。

　　2.2 金属针和非金属针针刺对骨骼肌细胞膜电位的影响

　　2.2.1 长时间电刺激对骨骼肌细胞膜电位的影响实验肌和对照肌在电刺激45min后，于无针刺处理、单纯休息10min的情况下，对比两束肌细胞实验前后膜电位的变化及幅值，见表1和图2。

　　2.2.2 不锈钢针和竹针针刺对长时间电刺激诱发的骨骼肌细胞膜电位变化的影响 在电刺激45min后，对实验肌即刻进行不锈钢针或竹针刺处理，对照肌无针刺处理，单纯休息10min的情况下，对比肌细胞膜电位的变化及幅值，见表1和图2。

　　3 分析与讨论

　　针刺疗法是我国传统医学临床治病的主要手段之一。在治疗肌肉疾患和促进肌肉功能恢复方面，针刺疗法占有重要的地位。从进针的角度看，目前在治疗肌肉疾患时所使用的针刺方法主要有直刺和斜刺两类（直刺时针与皮肤约呈直角，斜刺时针与皮肤间有一定的倾斜角）。现有资料表明，两种针刺方法均有较好的临床疗效，也有人已注意到在治疗某些肌肉疾患时，斜刺比直刺效果更为显著。斜刺阿是穴对肌肉损伤治疗作用的临床和实验研究发现，往往在针刺后数秒到几分钟内就会出现条索软化、疼痛消失、功能恢复的明显疗效。电镜下观察，针刺可使损伤肌肉超微结构的紊乱恢复正常，同时使肌肉收缩蛋白的免疫标记密度和相应的收缩结构改变得到改善。有文献报道，大负荷斜蹲后骨骼肌细胞出现z线扭曲、肌原纤维等改变；而直刺和斜刺均可减少这些变化，在对Z线扭曲的作用上斜刺优于直刺。本实验根据临床及实验研究，选用斜刺方式。 　　有关针刺对运动性损伤肌的促恢复作用在人体及动物实验中均得到证实。除电镜对骨骼肌超微结构的观察外，屈竹青等对针刺前后细胞内钙、镁、钠、钾等离子的分析及细胞膜、肌浆网膜ATP酶活性的测定也发现，针刺的作用是通过细胞膜Na-Ca交换，促使细胞内增多的Ca2+外排而完成的。针刺的作用机制目前认为可能是通过加强收缩蛋白的组装、合成，使损伤肌肉的结构与机能恢复正常，同时使疼痛缓解。尽管对于针刺作用机理的研究很多，但是关于针刺对细胞电学特性方面影响的研究十分匮乏。本研究即采用电生理学的微电极技术，于蟾蜍骨骼肌细胞上证实了长时间电刺激可以诱发其细胞膜电位向去极化方向发展，斜刺具有促进长时间电刺激后骨骼肌细胞膜电位恢复的效应。而且不论是金属针（不锈钢针）还是非金属针（竹针）均有此效应，二者的作用元显著性差异，提示针刺治疗骨骼肌损伤的作用效果并非源于金属针的电场或磁场作用。

　　本研究所采用的实验标本是从一块骨骼肌上分离出的两束肌细胞。首先我们观察了在无电刺激、无针刺的条件下，于任氏液内单纯放置1～2h，骨骼肌细胞膜电位的变化。如图1所示，肌细胞膜电位并无明显变化。说明我们后续实验中将整个时程控制在两小时内，来观察长时间电刺激引起的骨骼肌细胞膜电位的变化，以及针刺对长时间电刺激后骨骼肌细胞膜电位变化的影响作用是可行的。

　　我们的实验发现，长时间电刺激后，骨骼肌细胞膜电位降低，向去极化方向发展，如表2所示。这一研究结果与国外一些学者的研究结果是一致的。例如，Sigward使用大白鼠的比目鱼肌和趾伸肌，利用电刺激的方式诱发肌肉标本运动至疲劳，并采用微电极技术直接观察了对照组和电刺激组的膜电位变化，发现电刺激肌肉收缩至疲劳可使肌细胞膜电位降低，即使膜电位向去极化的方向发展。关于长时间电刺激后，引起的骨骼肌细胞膜电位降低，向去极化方向发展的机制仍在探索中。Sigaard的研究发现，长时间电刺激后引起的骨骼肌细胞膜电位降低的同时，肌细胞内钾离子浓度也降低，因此他认为二者之间存在联系。我国学者也发现长时间电刺激后骨骼肌细胞膜内离子浓度及酶活性均发生变化。因此，我们实验中所发现的长时间电刺激后骨骼肌细胞膜电位向去极化方向发展，很可能也与肌细胞内离子浓度的变化有关，但仍需进一步探讨。

　　本研究发现，经过45min电刺激后，给予其中一束肌细胞针刺处理，另一束肌细胞元针刺处理的实验条件下，两束肌细胞的膜电位变化幅度之间出现显著性差异。进行不锈钢针针刺处理的肌细胞膜电位变化幅度是（12.83±2.74）mV，而无针刺处理的肌细胞膜电位变化幅度却是（28.05±2.88）mV。经检验，两者之间存在显著性差异。竹针针刺组的研究结果也发现，进行竹针针刺处理的肌细胞膜电位变化幅度是（14.14±4.04）mV，也与无针刺处理的肌细胞膜电位变化幅度之间存在显著性差异。但是，不锈钢针和竹针两个处理组之间不存在显著性差异。针刺后膜电位出现恢复，恢复程度在不锈钢针针刺组和竹针针刺组分别达到85.18%和84.32%。这说明长时间电刺激后对骨骼肌细胞进行金属针刺或进行非金属针刺的处理，均有促进肌细胞膜电位恢复的作用，使骨骼肌细胞膜电位向复极化方向发展，但是效果无明显差异。因此，我们可以推断目前常用的金属针刺对骨骼肌损伤的治疗作用并非由于金属针的电场或磁场作用引起。

　　4 结论

　　针灸具有悠久的历史，古人曾用石针刺透肌肤和穴位。石针的磨制非常费时费力，容易折断，也不易普及。所以后来古人改用竹针来制造针具，例如把老竹经油炸处理后削成为既坚又韧的竹针，这就是“箴”。再进一步，当金属冶炼术发展起来后，又改用青铜针具或贵金属针具，如金针、银针等，这就是“鍼”。随着冶金技术的进步，人们制成了金属针（称为微针），并用微针对经脉进行治疗。金属针逐渐代替了以往的砭、箴，从而加强了针灸术的实用性，加快了针灸的发展进程。我们的研究，第一次从细胞膜电位的变化这个角度，采用细胞内记录的方式，不仅证实了斜刺具有促进长时间电刺激引起的骨骼肌细胞膜去极化的恢复作用，而且金属针刺和非金属针刺均有相似效果，充分说明目前所用的金属针刺治疗骨骼肌损伤的效果并非源于金属针刺的电场或磁场效应。