大肠菌群的测定
大肠菌落计数的平板计数法
检验方法:
分离培养与菌种鉴定、计数:
1.1 样品的稀释
1.1.1 固体和半固体样品:称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,
8000 r/min~10000 r/min 均质1 min~2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋
中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成1:10 的样品匀液。
1.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶
(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10 的样品匀液。
1.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5~7.5 之间,必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。
1.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL,沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液
或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1 支1 mL 无菌
吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:100 的样品匀液。
1.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每
递增稀释
1 次,换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15 min。
1.2 平板计数
1.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL生理盐
水加入无菌平皿作空白对照。
1.2.2 及时将15 mL~20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心
旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平
板,置于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。
1.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在15 CFU~150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5 mm 或更大。
1.4 证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB 肉汤管内,36 ℃±1 ℃
培养24 h~48 h,观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
1.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以1.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g
(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取
其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105 CFU/g(mL)。