小分子与核酸相互作用的研究进展

分析化学(FE NXI H UAX UE ) 　评述与进展第9期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第32卷小分子与核酸相互作用的研究进展

吴会灵31,2　杨　原1　张重杰3　何锡文4

1

32(复旦大学化学系, 上海200433) 　　　(第二军医大学药学院, 上海200433) 4(山西新华化工有限公司, 太原030008) 　　　(南开大学化学系, 天津300071)

摘　要　评述了小分子与核酸相互作用的结合模式和研究方法。引用文献59篇。

关键词　小分子, 核酸, 相互作用, 评述

1　引　　言

分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从基因水平理解某些生命现象, 并通过分子设计来寻找灵敏的核酸探针和有效的治疗药物。一方面,DNA 靶向化合物成为很重要的核酸探针选择对象。另一方面, 临床上使用的许多抗癌药物都以DNA 为作用靶点, 通过与癌细胞DNA 发生相互作用破坏其结构, 进而影响基因调控与表达功能, 表现出抗癌活性; 一些致癌物也能与DNA 形成加合物, 这种DNA 加合物也是可能癌变的预警标志物。因此, 小分子与DNA 的相互作用的研究不仅有利于探索和开发新的核酸探针, 而且有助于从分子水平上了解抗癌药物的作用机理, 阐明有毒物的致癌、致畸的分子生物学机理, 为设计临床上更为有效的抗癌药物提供理论指导。

2　作用方式

小分子与核酸的结合区位于核酸的碱基、磷酸骨架以及戊糖环部分。核酸由平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核苷酸链形成的大沟、小沟组成了小分子的识别位点。作用方式主要有3种:非共价键结合、共价键结合和剪切作用。非共价键结合又可分为表面结合(Outside binding ) 、沟槽结合(G roove binding ) 和嵌插结合(Intercalation binding ) 3种模式(图1) [1,2]。一般认为表面结合的小分子作用于DNA 双螺旋结构的外壁, 无选择性。沟槽结合是与核酸的大沟或小沟的碱基对边缘直接作用, 大分子蛋白质结合于DNA 的大沟槽中, 而大多数小分子则是在小沟槽区作用。小沟槽内是A ・T 富集区, 小分子通过与胸腺嘧啶碱基C 22上的羰基氧或腺嘌呤碱基N 23上的氮形成氢键与A ・T 碱基结合。嵌插结合是小分子中的平面成分嵌入核酸的碱基之间。因为小分子的结构不同, 嵌插剂又可细分为单嵌插剂和双嵌插剂[3]。与非共价键结合作用相比, 小分子与DNA 的共价键结合的序列特异性识别能力要强的多。共价键结合的小分子多表现为链内交联或链间交联, 与特定碱基作用形成加和物, 使核酸双链解旋且产生弯曲。

3　研究方法

人们采用多种现代实验手段如紫外可见吸收光谱、线二色光谱、圆二色光谱、荧光光谱、拉曼光谱、傅里叶转换红外光谱、核磁共振、质谱、电化学、微量热、电泳及粘度等方法从不同角度对小分子与核酸之间的作用进行了广泛的研究。

3. 1　紫外可见吸收光谱法

紫外可见吸收光谱是研究小分子与核酸相互作用的一种最方便、最常用的技术。小分子与核酸的相互作用会引起吸收带的红移(蓝移) 现象或增色(减色) 效应。吸光度减小、吸收带红移以及等吸收点的形成是小分子与DNA 发生嵌插作用的光谱标志[4]。

热和碱的作用可破坏DNA 双链螺旋结构, 使双链变成单链, 吸光度A 260增大。小分子与DNA 结合　2002211211收稿;2004202217接受

本文系国家自然科学基金(N o. 29975014) 资助项目

第9期吴会灵等:小分子与核酸相互作用的研究进展125　　

7后会给这种变性带来影响, 进而可考察小分子与

DNA 的作用方式。嵌插作用对DNA 的双螺旋结构

起稳定作用, 可导致熔链温度T m 值增大5～8℃, 而

非嵌插作用的小分子不会使T m 值增大如此明显[5]。

G anesh 等[6]报道了阳离子表面活性剂与寡聚核苷酸

作用后A 260随温度的变化曲线为双sigma 曲线, 由此

推断阳离子表面活性剂首先通过静电作用与寡聚核

苷酸结合, 然后在疏水力的驱动下以协作方式结合

于相同的寡聚核苷酸上, 从而使溶液中同时存在两

种寡聚核苷酸, 即自由和与表面活性剂结合的寡聚　图1　小分子和DNA 的作用模式核苷酸, 最终导致出现两个熔链温度。跟踪小分子Fig. 1　The binding m odes between small m olecule and de 2与DNA 作用前后A 260随pH 值的变化情况, 也可判断oxyribonucleic acid (DNA )

小分子与DNA 之间的作用方式。文献[7]研究了

G e 2132与DNA 的相互作用, 在G e 2132不存在的情况

下,DNA 碱变性的pHb 为12127, 变性后增色26%; 而在G e 2132存在下,DNA 碱变性的pHb 增大为12. 90, 变性后增色14%, 因此初步判断:G e 2132以嵌插方式与DNA 发生了作用。

3. 2　线二色光谱和圆二色光谱

线二色光谱(LD ) 采用与固定光轴方向平行或垂直的平面偏振光, 能快速区分经典的嵌入结合、沟槽结合和表面结合模式, 并能获得小分子结合在DNA 上的准确方向信息及动力学数据[8]。圆二色光谱(C D ) 以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光, 为有机化合物的绝对构型、构象和反应机理的研究提供了很多信息, 是研究有机化合物和生物大分子的构型、构象和三维空间结构强有力的工具。一方面根据DNA 在260nm 处的吸收提供有关结构信息, 另一方面对一些本身没有C D 信号, 但与DNA 结合后能产生诱导C D 信号的分子, 可获得一定的有关其结构的间接信息。Fiel 等[9]研究了卟啉配体与DNA 之间的相互作用, 圆二色光谱技术为二者之间的嵌插和非嵌插作用提供了有力的证据。彭小彬等[10]通过圆二色光谱等手段研究了手性苏氨酸卟啉锌配合物的超分子聚集体与小牛胸腺DNA 构建的新超分子, 依据卟啉与DNA 作用时C D 光谱的外型来判断卟啉与DNA 的结合模式, 提出了具有不同构型的手性苏氨酸卟啉锌配合物聚集体与DNA 构建新的超分子时不同的构建方式。最近,Z inchenko 等[11]报道了R (CH 3) 2N +(CH 2) n N +(CH 3) 2R 类化合物与DNA 之间的作用机理。基于C D 光谱的研究发现, 二价阳离子诱导DNA 由B 型转变成A 型的驱动力大小取决于两电荷间的距离, 而与取代烷基的长度无关。

3. 3　荧光光谱法

荧光光谱法是研究小分子与核酸相互作用的主要手段。溴化乙锭(E B ) 是应用最早的荧光探针, 被广泛应用于抗癌药物的筛选和小分子与DNA 作用的研究[12～14]。DNA 三螺旋结构的发现, 扩展了溴化乙锭的应用范围, 使其在检测三螺旋DNA 和研究其与三螺旋DNA 作用等方面发挥了作用[15,16]。

KI 和K 4Fe (C N ) 6为典型荧光猝灭剂, 通过考察其对小分子荧光的猝灭作用可以判断小分子与DNA

-之间的作用方式。与纯水介质相比, 当小分子与DNA 属于嵌插作用时, I -或Fe (C N ) 4的猝灭作用减6

弱[17]; 而当小分子与DNA 属于沟槽作用时, 猝灭作用增强[5]。

小分子与DNA 作用后荧光偏振的变化情况是判断小分子是否与DNA 发生嵌插作用的又一标准。通常当小分子嵌插到碱基中时, 其转动受阻, 荧光偏振会随之变大, 而非嵌插作用不会引起荧光偏振的增大[18]。文献[19]利用荧光偏振方法研究了小分子与DNA 之间的相互作用, 小分子的荧光偏振随着DNA 浓度的增加而增大, 由此推断小分子与DNA 发生了嵌插作用。花青染料分子中间为多次亚甲基桥, 当其与DNA 发生嵌插或沟槽作用时, 因次亚甲基键的扭转受到限制, 可导致其荧光强度的增强, 据此可判断花青染料是否以嵌插或沟槽作用方式与DNA 结合[18,20,21]。

　　1258分析化学第32卷

3. 4　拉曼光谱法

拉曼光谱是一种富含信息的分析技术, 这种特定技术与共振和表面增强现象相结合使其逐渐成为一种极具诱惑力的生物医学分析技术。Is ola 等[22]对HI V DNA 进行标记, 并与表面增强拉曼技术相结合, 使拉曼信号显著增强, 其灵敏度与荧光标记法相当, 却比后者能提供更多的结构信息。文献[23,24]利用共振拉曼光谱研究了抗癌药物Amsacrine 、Adriamycin 及112deoxycarminomycin 与DNA 之间的相互作用, 表明它们均以嵌插方式与DNA 结合; 而Sav oie 等[25]借助拉曼光谱对Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+和Cd 2+与小牛胸腺DNA 相互作用的构象变化、结合位点进行了研究

, 金属离子浓度较低时, 金属离子与

DNA 上的磷酸基团结合, 并导致聚核苷酸结构的微小变化2+和Zn 2+与

G ・C 碱基对结合时, 二者的亲和力相当, 而当与

A ・T 碱基对结合时,Cd 2+

比Zn 2+。

3

. 5　红外光谱法

近年来, 傅里叶变换红外光谱法在小分子与DNA

相互作用的研究中得到了广泛应用。文献[26]报道了致癌物质diethylstilbestrol (

DES ) 与小牛胸腺DNA 之间的作用模式、结合常数、序列选择性以及DNA 结构和构象的变化情况。当DES 浓度较低时,A ・T 富集区是DES 与DNA 发生嵌插作用的主要位点, 伴随着这种嵌插结合过程,DNA 逐渐由B 型向A 型转变; 当DES 药物浓度较高时,DES 与G ・C 碱基发生作用, 并削弱了DNA 双螺旋结构的稳定性。Neault 等[27]利用傅里叶转换红外光谱技术研究了叶绿酸(CH LN ) 及叶绿素(CH L ) 与DNA 之间的相互作用, 并对CH LN 2DNA 、CH L 2DNA 以及金属卟啉2DNA 3种加合物的性质进行了比较。Zhou 等[28]通过红外等光谱手段对聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA ) 与DNA 之间的作用方式进行了研究。红外光谱研究结果表明,PDDA 与DNA 分子中的碱基和磷酸基团发生了作用, 且DNA/PDDA 复合物的形成导致DNA 二级结构构象发生了变化。Dupuis 等[29]红外光谱和拉曼光谱对Cd 2+与DNA 之间的相互作用进行了研究, 。通常硬离子主要与核酸分子的磷酸基团结合, 软离子与碱基结合[30]。按照Lewis 理论,Cd 2+是介于硬离子和软离子之间的一种交界离子, 因此Cd 2+既可与磷酸基团作用, 又可与碱基作用。

3. 6　核磁共振分析法和质谱法

核磁共振(NMR ) 分析法可以定量确定结合位点的化学变化, 并且对长距离驰豫效应更为准确。NMR 中的S AR 是最早报道的用NMR 方法筛选靶向RNA , 并且可以通过靶向蛋白质的二维1H 215N 光谱筛选附近亚结合位点的小分子物质[31]。Zhou 等研究结果证明抗癌药物放射菌素D 以嵌插方式与寡聚核苷酸[d (ATCG AT ) ]2作用。Jung (Csp ) 在343K 及室温下三维结构特征时发现,Csp 的分子开关功能直接与相邻于两个β2bulges 的氨基酸残基的构象变化相关。随着软电离技术的发展, 质谱法在小分子与DNA 加合物的结构分析中发挥着独特的作用[34～36], 该方法能灵敏快速地获得小分子与DNA 作用的结合区域、结合位点数、亲和力以及非共价键结合方式等信息。

3. 7　电化学方法

在研究小分子与核酸的相互作用中, 虽然电化学方法在一定程度上受分子电活性的限制, 但对于一些吸收光谱比较弱, 或与核酸作用前后光谱无明显变化, 而无法用诸如紫外可见、荧光等光谱手段来研究的分子, 却有可能用直接或间接伏安法方便地进行研究。Bard 等[37]将电化学方法应用于研究溶液中DNA 与电活性金属配合物之间的相互作用, 其缺点是DNA 用量大、背景信号干扰强。基于DNA 修饰电极发展起来的表面电化学方法将有助于此类问题的解决[38,39]。Pang 等[40]建立了一种制备DNA 修饰电极的简便方法, 修饰电极表面固定的DNA , 可方便地研究DNA 与小分子的相互作用, 且灵敏度高。李启隆等, 并用于研究博莱霉素与DNA 相互作用的电化学行为及其应用, 这种电极稳定性和重现性优于一般的化学修饰电极。Chen 等[42]将β2环糊精(β2C D ) 的包络作用引入到小分子与DNA 作用研究体系中, 利用光谱电化学方法研究了染料分子被β2C D 包络前后与DNA 作用性质的变化, 阐述了染料与DNA 的作用机制。

3. 8　微量热法

微量热法在测定过程中不会干扰生物体系的正常活动与代谢, 对反应体系的光谱性质、电学性质及溶剂性质等无任何限制条件, 因而有许多独到之处[43]。微量热法已先后被用于一些抗肿瘤药物、生物染料以及金属配合物与DNA 相互作用的研究, 包括热力学性质、结合位点及键合模式的研究[44～47]。

3. 9　能量转移方法

一些染料与核酸结合时, 光谱特性往往允许从染料到核酸或在染料之间进行有效的长距离能量转移。发生有效能量转移的条件是苛刻的, 主要包括:给体分子本身能发荧光; 给体的荧光光谱和受体的吸收光谱有相当程度的重叠; 给体与受体之间的距离必须足够接近(根据理论计算大约在7nm 以内) 。对于生化分析者来说, 能量转移现象的重要意义在于转移效率是发生转移的两个基团距离的函数, 因此由转移效率可以测定分子之间的距离。

能量转移技术对生物大分子结构的分析在溶液中进行, 无需复杂的结晶等样品处理步骤, 因而快速、灵敏, 与X 2射线晶体衍射法相比, 其测定结果更能反映生物大分子结构与功能之间的关系。文献

[48]利用时间分辨共振能量转移技术研究了不同臂末端之间距离的分布情况, 发现重叠区域间距离分布较窄, 说明这些部分具有相对刚性。能量转移技术也可用于DNA 点突变的探测、跟踪记录分子结构

[49,50]的动态变化从而对反应机理的研究提供大量宝贵信息。此外, 能量转移技术利用普通的荧光仪可

以进行灵敏、快速的核酸杂交测定, 与放射分析相比具有相当的灵敏度, 却避免了繁琐的分离手续。Six ou 等[51]以能量转移技术在活细胞内进行了核酸杂交实验, 分别在5′和3′端标记了寡聚核苷酸单链及其互补链, 并将二者的杂交物注入活细胞中, 观察其降解反应, 发现注入细胞的寡聚核苷酸可以与胞浆中及核内非同源的互补链杂交。

3. 10　凝胶电泳方法

凝胶电泳法是生物学中最常用的分离、纯化、鉴定、制备DNA 片段以及研究DNA 分子结构、构象和断链的重要手段。Fiel 等[52]认为嵌插作用可导致小分子2DNA 复合物电泳迁移率明显降低, 而仅仅静电作用不会对迁移率产生大的影响, 据此可初步判断小分子是否与DNA 发生了嵌插作用。文献[53]比较了耐尔蓝2DNA 、E B 2DNA 和DNA 电泳迁移率的大小, 得出耐尔蓝以嵌插方式与DNA 发生作用。文献

[54]通过琼脂糖凝胶电泳技术研究了二茂钛二甘氨酸盐与P BR322DNA 的作用, 发现它与P BR322DNA 之间不存在任何嵌插作用, 而且不会引起DNA 链的缺刻。文献[55]报道了二价金属离子对平阳霉素与DNA 作用的影响。电泳实验表明, 当Fe 2+浓度较低时, 其作用主要是促进平阳霉素对λ2DNA 的降解; 当Fe 2+浓度较高时, 一方面起促进作用, 另一方面它本身也会降解λ2DNA 。随着Fe 2+的浓度增大, 产生平阳霉素严重降解DNA 的现象。而在人体内, 金属离子属微量元素, 因此猜想Fe 2+主要起促进作用。王玉琦等[56]利用生化分离流程及琼脂糖凝胶电泳从铁芒萁叶中提取出纯度比较高的稀土元素2DNA 复合物, 并证明稀土元素与DNA 的结合是紧密的。

3. 11　其它方法

Lerman [57]认为粘度增大、沉降系数减小是小分子与DNA 发生嵌插作用的主要标志之一。Fiel 等[58]研究了卟啉T M AP 、T2M pyP 、T3M pyP 及与DNA 之间的相互作用。粘度数据表明:T3M pyP 和T4M pyP 以嵌插方式与DNA 发生了作用, 而T2M pyP 和T M AP 与DNA 以非嵌插方式作用。Haq 等[59]用粘度法检验了Δ2Ru (phen ) 2(dppz ) 2+和Λ2Ru (phen ) 2(dppz ) 2+对DNA 的流体动力学特性的影响, 发现它们均能使DNA 的杆状链伸展, 并使溶液的粘度增加, 为插入键合模式提供了有力证据。

此外还有许多种方法如平衡渗析、原子力显微镜(AFM ) 、扫描隧道显微镜(ST M ) 、亲和色谱法以及X 2射线晶体衍射法等可用于小分子与DNA 相互作用机理的研究。其中X 2射线晶体衍射法结合分子动力学模拟计算可获得非常详细的小分子与DNA 结合位点及结构变化的信息, 以及一定的动力学数据。总之, 对于小分子与DNA 复杂体系的研究, 必须综合运用各种方法和手段进行全方位、多层次的深入研究以确保准确理解其相互作用。

4　展　　望

人们对于小分子与核酸相互作用的研究已经取得了一定的理论知识, 但仍有许多问题有待解决。

进一步研究其相互作用需要生物学、化学、医学、物理学、计算机学及电子学等多学科的协作, 可以预计今后的研究将会在以下几个方面有所发展:(1) 深入了解药物与DNA 的相互作用机理, 认识某些疾病致病机制和药物治病机理, 从而对新药的合成和体外筛选工作进行指导; (2) 通过检测环境污染物或致癌物与DNA 的相互作用, 揭示某些基因突变的原因, 寻找快速测定基因突变的方法以及相应的基因治疗药物; (3) 将核酸探针与其他能够光解核酸的试剂连接在一起, 让核酸探针起引导切割反应的作用, 设计出具有特异性位点的DNA 光化学切割剂, 以满足分子生物学、分析化学、遗传基因工程、基因疗法等诸多前沿领域对核酸切割剂的需求; (4) 研究蛋白质模拟化合物与DNA 相互作用的机理, 加深对生命现象的理解; (5) 生物活性物质的检出灵敏度极限是单个分子, 发展高灵敏度的核酸或蛋白质分子探针以满足生命科学的飞速发展。

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Study on the I nteraction of Small Molecules with Nucleic Acids

Wu Huiling 31,2, Y ang Pengyuan 1, Zhang Zhongjie 3, He X iwen 4

1(Department o f Chemistry , Fudan Univer sity , Shanghai 200433)

2(School o f Pharmacy , Second Military Univer sity , Shanghai 200433)

3(Shanxi Xinhua Chemicals Company , Taiyuan 030008)

4(Department o f Chemistry , Nankai Univer sity , Tianjin 300071)

Abstract 　The binding m odes and investigation methods for the interaction between small m olecules and nucleic acids were reviewed. 59references were quoted.

K eyw ords 　Small m olecules , nucleic acids , interaction , review

(Received 11N ovember 2002; accepted 17February 2004)