冬凌草甲素.乙素的研究进展
摘要:冬凌草甲素、乙素具有多种药理作用,尤其是抗癌活性。本文通过分析近年国内外发表的文献,综述冬凌草甲素、乙素的提取、分离、药理、制剂、药动学等。冬凌草甲素、乙素的药用价值值得进一步研究,应更深层次地开发利用。 关键词:冬凌草甲素、乙素;提取;分离;抗癌作用;制剂;药动学 中图分类号:R284文献标识码:A文章编号:1672-979X(2008)09-0072-04 Progress on Rubescensine A and B DAI Yi, SUN Long-ru (School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China) Abstract:Rubescensine A and B have many pharmacological actions, especially anticancer activity. This paper reviews the latest research status of rubescensine A and B by collecting and analyzing literature from many countries, including extraction, separation, pharmacological action, pharmaceutical preparation and pharmacokinetic. The medicinal value of rubescensine A and B is worth being further investigated. Key words:rubescensine A and B; extraction; separation; anticancer effect; pharmaceutical preparation; pharmacokinetic 冬凌草甲素、乙素是唇形科(Labiatae)香茶菜属(Rabdosia)植物中的2种重要活性二萜成分,主要植物来源是香茶菜(Rabdosia amethystoides)、显脉叶香茶菜(Rabdosia nervosa)、毛叶香茶菜(Rabdosia rabdosia)、道孚香茶菜(Rabdosia downsis)和冬凌草(Rabdosia rubescens)、延命草(Isodon japonicus)等。唇形科香茶菜属植物全球约150种,中国是该属的分布中心,有100多种。它含有的生物活性成分对映杉烷型二萜类化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗炎等药理活性。上世纪70年代首次分得冬凌草甲素并发现其良好的药理作用,自此冬凌草甲素、乙素即在国内外引起了广泛关注。现对其提取、分离、药理作用、制剂及药动学等方面的研究进展进行综述,以期进一步促进冬凌草甲素、乙素新药制剂的研究与开发。 1冬凌草甲素、乙素提取与分离 邢洁等[1]研究了超临界CO2提取冬凌草甲素的最佳提取工艺为压力38.5 MPa,温度40 ℃,夹带剂用量1.5 mL/g。柱色谱进一步分离可制备高纯度冬凌草甲素。Lu 等[2]将冬凌草乙醇提取物上硅胶柱,用石油醚/丙酮混合溶液洗脱得粗提物,用制备型逆流色谱(CCC)分离200 mg冬凌草甲素粗提物得纯度97.8 %的冬凌草甲素120 mg。Lu 等[3]用制备型二维逆流色谱(2D-CCC)对约250 mg冬凌草粗提物进行9 h的分离得60 mg冬凌草甲素和10 mg冬凌草乙素,HPLC测定纯度都在95 %以上,获得了满意的结果。 2抗肿瘤作用 2.1冬凌草甲素的抗肿瘤作用 2.1.1抗白血病Ikezoe等[4]研究发现,冬凌草甲素抑制多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病和成人型T细胞白血病细胞的生长。缺口末端标注技术(TUNEL)显示,冬凌草甲素以时间依赖性引起白血病MT-1细胞凋亡。冬凌草甲素下调Bcl-2 家族的Mcl-1和BCL-xL水平,但不能下调MT-1和骨髓瘤RPMI8226细胞中的Bcl-2蛋白。进一步研究发现,冬凌草甲素在这些细胞中抑制了转录因子NF-κB与靶DNA区段的结合活性。冬凌草甲素还能抑制造血系细胞Jurkat、巨噬细胞RAW264.7细胞中由TNF-α和LPS刺激诱导产生的NF-κB活性。但冬凌草甲素不影响健康志愿者的正常淋巴细胞存活率。Liu等[5]研究了冬凌草甲素体外对白血病HPB-ALL细胞株抗增殖和凋亡诱导作用及其机制。结果显示,冬凌草甲素能以时间、剂量依赖方式显著抑制HPB-ALL细胞增殖并促使其凋亡。在给予冬凌草甲素48 h后,伴有凋亡细胞的标志性变化,线粒体膜电势(ΔΨm)破裂的百分数以剂量依赖方式逐渐增加,在给予冬凌草甲素72 h后,坏死细胞显著增加。给予冬凌草甲素24 h后,这些细胞的Bcl-2 和Bcl-xl蛋白表达显著下调,而促凋亡蛋白Bax和Bid表达上调。 2.1.2抗鼻咽癌、肺癌朱国臣等[6]发现,冬凌草甲素能抑制人鼻咽癌CNE-2细胞生长,诱导其凋亡并坏死,流式细胞分析发现“亚二倍体峰”,冬凌草甲素作用后CNE-2细胞处在G2/M期的比例增多。此外,他们研究了冬凌草甲素的放射增敏比。Liu等[7]的研究发现,冬凌草甲素(>28μmol・L-1)能抑制肺癌SPC-A-1细胞增殖并诱导凋亡。观察到凋亡细胞的形态明显变化,特别是用冬凌草甲素处理48~60 h的细胞48 h后,蛋白印迹法分析显示bcl-2表达下调而bax 蛋白表达上调。 2.1.3抗肝癌、胆囊癌Zhang等[8]在体外培养基中给予肝癌BEL-7402细胞不同浓度的冬凌草甲素后,发现冬凌草甲素能以时间、剂量依赖方式抑制BEL-7402细胞增殖并引起细胞显著凋亡。细胞接触冬凌草甲素60 h后,观察到凋亡细胞的形态明显变化;蛋白质印迹法显示,caspase-3酶原蛋白(32×103)分裂出现20×103的亚单位;细胞凋亡过程中,观察到Bcl-2蛋白表达下调而Bax蛋白表达上调。不同浓度的冬凌草甲素处理人胆囊癌GBC-SD细胞,能诱导细胞凋亡,并呈浓度依赖性。药物作用24 h后,对照组和实验组细胞中p53,bcl-2,fas/apo-1及c-myc 蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)[9]。 2.1.4抗黑色素瘤、皮肤癌Ren等[10]研究发现,冬凌草甲素以时间剂量依赖方式抑制培养的鼠黑色素瘤K1735M2细胞的生长。进一步研究表明,其抑制效应与剂量依赖的G2/M相停止和分化诱导有关。形态学观察显示,冬凌草甲素能诱导K1735M2细胞产生树突状结构。迁移结果表明,冬凌草甲素以剂量依赖方式影响K1735M2细胞的活力。Li 等[11]给予人皮肤癌A431细胞不同剂量的冬凌草甲素24 h后,发现冬凌草甲素对A431细胞酪氨酸激酶活性有一定的抑制能力。酪氨酸激酶活性降低和EGFR酪氨酸磷酸化阻断可能是冬凌草甲素诱导A431细胞坏死的一个原因。
2.1.5抗宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等崔侨等[12]等发现,冬凌草甲素明显抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,诱导其凋亡并发生自噬。冬凌草甲素作用24 h后,促凋亡蛋白Bax、细胞色素C和控制Bax活力的去乙酰化酶SIRT-1的表达明显改变。冬凌草甲素(64μmol/L )诱导的自噬通过影响SIRT-1和线粒体途径蛋白表达下调凋亡。Chen等[13]研究了冬凌草甲素对人前列腺癌(DU-145,LNCaP)、乳腺癌(MCF-7)和卵巢癌(A2780 和PTX10)细胞生物活性的影响。冬凌草甲素对所有被测定的癌细胞都有抗增殖活性,IC50在5.8±2.3~11.72±4.8 μmol/L范围。更值得注意的是,冬凌草甲素诱导癌细胞凋亡的浓度不能诱导培养的正常人成纤维细胞凋亡。 2.1.6其他 Liu 等[14] 研究发现,当鼠脾淋巴细胞和冬凌草甲素一起培养时,冬凌草甲素有效地以剂量、时间依赖方式抑制刀豆蛋白ConA刺激的细胞过度增殖。抑制活性主要是干涉DNA复制和调节了细胞周期所致,CD4+、CD8+淋巴细胞水平降低也起了作用。二甲苯诱导的鼠耳肿胀模型结果表明,冬凌草甲素降低了鼠耳肿胀程度和动物血清中IL-2水平。ELISA测定结果表明,冬凌草甲素能抑制鼠脾淋巴细胞分泌IL-2,IFN-γ,IL-12p40和TNF-α的能力,而且逆转录PCR的结果证明,抑制是通过降低这些细胞因子mRNA表达水平实现的。MTT法测定显示,冬凌草甲素以时间、剂量依赖方式抑制人结直肠癌HT29细胞的增殖。体内实验表明, HT29细胞在小鼠体内培育24 h后,腹腔注射冬凌草甲素(10,15,20 mg/kg体重,1~12 d)也观察到实体瘤受抑制[15]。Jin等[16]的研究结果显示,冬凌草甲素以浓度、时间依赖方式抑制骨肉瘤细胞U2-OS,MG-63和SaOS-2增殖并诱导凋亡。 冬凌草甲素能够诱导细胞色素释放,并伴随caspase-9,caspase-3,PARP激活。 2.2冬凌草乙素的抗肿瘤作用 Liu等[17]的研究结果显示,冬凌草乙素能以时间、剂量方式显著抑制人骨髓瘤细胞系K562和HL-60细胞的增殖并诱导凋亡。用冬凌草乙素处理细胞48~72 h后,可以清楚地观察到细胞凋亡。凋亡发生时,caspase-3酶原蛋白(32×103)分裂出17×103亚单位,同时相对分子质量为116×103 的PARP分裂产生89×103组分。冬凌草乙素处理细胞24~48 h后,Bcl-2表达下调而Bax表达上调。Zhang等[18]研究发现冬凌草乙素显著抑制人肝癌细胞系QGY-7701 和HepG-2 细胞增殖并诱导凋亡,其机制是Survivin 和Bcl-2 表达下调及Bax表达上调。 2.3冬凌草甲素和乙素抗肿瘤作用的比较 Zhang等[19]评价了体外冬凌草甲素和冬凌草乙素对癌细胞和人外周血单个核细胞(PBMC)的抗增殖活性。冬凌草甲素比冬凌草乙素对4种癌细胞(人黑色素瘤A375-S2、人子宫癌HeLa、人乳腺癌MCF-7、鼠纤维肉瘤L929)有更强的细胞毒作用。冬凌草甲素对A375-S2细胞比对另外几种细胞有更强的增殖抑制活性。用冬凌草甲素34.3μmol/L处理12 h后,能显著抑制A375-S2细胞增殖,而对PBMC的作用较弱。而冬凌草乙素在相同条件下能显著抑制PBMC的生长。A375-S2细胞分别用冬凌草甲素34.3 μmol/L和137.4 μmol/L处理后显示冬凌草甲素诱导A375-S2细胞死亡是凋亡和坏死的平衡。Hsieh 等[20]测定了冬凌草乙素和冬凌草甲素对低侵袭性乳腺癌M细胞系MCF-7和高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞及正常乳腺细胞系MCF-10A细胞的作用,发现冬凌草乙素比冬凌草甲素能更有效地抑制MCF-7细胞集落的生成和增殖,但用于MCF-10A细胞则观察到相反的结果。在对MCF-7或 MCF-10A细胞都有效的剂量范围内,它们都不影响MDA-MB-231细胞的增殖。冬凌草乙素处理MCF-7细胞,发现cyclin-B1,cdc2转录因子E2F和780位Ser磷酸化的Rb表达水平均降低。而冬凌草甲素处理则无明显的作用。二者都不能改变MCF-7细胞的cyclin-D1和cdk4的表达。对于MCF-10A细胞,冬凌草甲素比冬凌草乙素能更有效地抑制cyclin-B1,cdc2转录因子E2F和780位Ser磷酸化的表达。进一步研究表明,冬凌草甲素处理MCF-10A细胞后,其NF-κB组分p65、p50及其上游调控子I-κB减少,对MCF-7细胞则无这种作用。 3冬凌草甲素的制剂 Xing等[21]通过自乳化溶剂扩散法制备了冬凌草甲素聚乳酸纳米粒,并通过体内、体外实验进行了考察。药动学实验表明,聚乳酸包载的纳米粒显著延长了冬凌草甲素在体内的循环时间。静脉注射冬凌草甲素聚乳酸纳米粒后,高浓度靶向聚集在肝、肺、脾,而分布在心脏和肾脏的浓度相应较低。刘培丽等[22]用相溶解度法研究羟丙基β-环糊精(HPCD)在溶液中对冬凌草二萜类成分的包合作用。HPCD 与冬凌草甲素形成摩尔比为1∶1 的包合物,包合过程为吸热过程,而且是自发进行的。 4冬凌草甲素的药动学 张典瑞等[23]考察冬凌草甲素固态类脂纳米粒在动物体内的组织分布及药动学特性。实验结果显示,冬凌草甲素固态类脂纳米粒能够增强药物的肝脾靶向性,提高药物生物利用度,在一定程度上延长了药物在动物体内的循环时间。Xu 等[24]用大鼠研究了静脉注射和口服冬凌草甲素的药动学和绝对生物利用度,认为在静脉注射剂量范围冬凌草甲素符合一级动力学而口服的绝对生物利用度很低且剂量依赖,可能是首过效应饱和所致。 5 结论 冬凌草甲素、乙素具有很好的抗癌活性,有着广阔的开发前景。目前,国内除了早期上市的冬凌草总提物制剂外,尚无冬凌草甲素、乙素的单体制剂。近年对冬凌草甲素的研究主要集中在生物活性上,在提取、分离、结构修饰、制剂及药动学等方面也作了很多有益的探讨;冬凌草乙素的研究近年也逐渐增多。近年的研究主要是冬凌草甲素,尤其是冬凌草甲素的抗肿瘤活性方面的实验报道较多。研究表明,冬凌草甲素具有较好的抗肿瘤活性,且对正常细胞毒性较低,具有很好的临床应用和开发价值。将冬凌草甲素开发成新药制剂,对开发利用丰富的自然资源具有重要的意义。 参考文献 [1]邢洁,张典瑞,张学顺,等.超临界CO2萃取-柱色谱分离联用制备冬凌草甲素新工艺的研究[J].中国药学杂志,2005,40(23):1804-1807. [2]Lu Y, Sun C, Pan Y. Isolation and purification of oridonin from Rabdosia rubescens using upright counter-current chromatography [J]. J Sep Sci , 2006, 29 (2): 314-318. [3]Lu Y, Sun C, Liu R, et al. Effective two-dimensional counter-current chromatographic method for simultaneous isolation and purification of oridonin and ponicidin from the crude extract of Rabdosia rubescens [J]. J Chromatogr A, 2007, 1146 (1): 125-130.
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