分子进化树构建及数据分析的简介(入门极品)[1]

分子进化树构建及数据分析的简介（入门极品）

[color=black][color=black][b]这是转来的一篇文章，来自丁香园。做病毒的兄弟姐妹肯定离不开进化树的构建和序列比对，及最重要的结果分析。不同的构建方法能带来截然不同的结果。我根据使用经验加了一些标注。[/b][/color]

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分子进化树构建及数据分析的简介

mediocrebeing, rodger, lylover , klaus, oldfish, yzwpf

一、引言

开始动笔写这篇短文之前，我问自己，为什么要写这样的文章？写这样的文章有实际的意义吗？我希望能够解决什么样的问题？带着这样的疑惑，我随手在丁香园（DXY）上以关键字“进化 分析 求助”进行了搜索，居然有289篇相关的帖子（2006年9月12日）。而以关键字“进化 分析”和“进化”为关键字搜索，分别找到2,733和7,724篇相关的帖子。考虑到有些帖子的内容与分子进化无关，这里我保守的估计，大约有3,000~4,000篇帖子的内容，是关于分子进化的。粗略地归纳一下，我大致将提出的问题分为下述的几类：

1．涉及基本概念。例如，“分子进化与生物进化是不是一个概念”，“关于微卫星进化模型有没有什么新的进展”以及“关于Kruglyak的模型有没有改进的出现”，等等。

2．关于构建进化树的方法的选择。例如，“用boostrap NJ得到XX图，请问该怎样理解？能否应用于文章？用boostrap test中的ME法得到的是XXX树，请问与上个树比，哪个更好”，等等。

3．关于软件的选择。例如，“想做一个进化树，不知道什么软件能更好的使用且可以说明问题，并且有没有说明如何做”，“拿到了16sr RNA数据，打算做一个系统进化树分析，可是原来没有做过这方面的工作啊，都要什么软件”，“请问各位高手用clustalx做出来的进化树与phylip做的有什么区别”，“请问有做过进化树分析的朋友，能不能提供一下，做树的时候参数的设置，以及代表的意思。还有各个分支等数值的意思，说明的问题等”，等等。

4．蛋白家族的分类问题。例如，“搜集所有的关于一个特定domain的序列，共141条，做的进化树不知具体怎么分析”，等等。

5．新基因功能的推断。例如，“根据一个新基因A氨基酸序列构建的系统发生树，这个进化树能否说明这个新基因A和B同源，属于同一基因家族”，等等。

6．计算基因分化的年代。例如，“想在基因组水平比较两个或三个比较接近物种之间的进化年代的远近，具体推算出他们之间的分歧时间”，“如何估计病毒进化中变异所需时间”，等等。

7．进化树的编辑。例如生成的进化树图片，如何进行后续的编辑，比如希望在图片上标注某些特定的内容，等等。

由于相关的帖子太多，作者在这里对无法阅读全部的相关内容而致以歉意。同时，作者归纳的这七个问题也并不完全代表所有的提问。对于问题1所涉及到的基本的概念，作者推荐读者可参考由Masatoshi Nei与Sudhir Kumar所撰写的《分子进化与系统发育》（Molecular Evolution and Phylogenetics）一书，以及相关的分子进化方面的最新文献。对于问题7，作者之一lylover一般使用Powerpoint进行编辑，而Photoshop、Illustrator及Windows自带的画图工具等都可以使用。

这里，作者在这里对问题2-6进行简要地解释和讨论，并希望能够初步地解答初学者的一些疑问。

二、方法的选择

首先是方法的选择。基于距离的方法有UPGMA、ME（Minimum Evolution，最小进化法）和NJ（Neighbor-Joining，邻接法）等。其他的几种方法包括MP（Maximum parsimony，最大简约法）、ML（Maximum likelihood，最大似然法）以及贝叶斯（Bayesian）推断等方法。其中UPGMA法已经较少使用。

一般来讲，如果模型合适，ML的效果较好。对近缘序列，有人喜欢MP，因为用的假设最少。MP一般不用在远缘序列上，这时一般用NJ或ML。对相似度很低的序列，NJ往往出现Long-branch attraction（LBA，长枝吸引现象），有时严重干扰进化树的构建。贝叶斯的方法则太慢。对于各种方法构建分子进化树的准确性，一篇综述（Hall BG. Mol Biol Evol 2005, 22(3):792-802）认为贝叶斯的方法最好，其次是ML，然后是MP。其实如果序列的相似性较高，各种方法都会得到不错的结果，模型间的差别也不大。

对于NJ和ML，是需要选择模型的。对于各种模型之间的理论上的区别，这里不作深入的探讨，可以参看Nei的书。对于蛋白质序列以及DNA序列，两者模型的选择是不同的。以作者的经验来说，对于蛋白质的序列，一般选择Poisson Correction（泊松修正）这一模型。而对于核酸序列，一般选择Kimura 2-parameter（Kimura-2参数）模型。如果对各种模型的理解并不深入，作者并不推荐初学者使用其他复杂的模型。

Bootstrap几乎是一个必须的选项。一般Bootstrap的值>70，则认为构建的进化树较为可靠。如果Bootstrap的值太低，则有可能进化树的拓扑结构有错误，进化树是不可靠的。

对于进化树的构建，如果对理论的了解并不深入，作者推荐使用缺省的参数。需要选择模型的时候（例如用NJ或者ML建树），对于蛋白序列使用Poisson Correction模型，对于核酸序列使用Kimura-2参数模型。另外需要做Bootstrap检验，当Bootstrap值过低时，所构建的进化树其拓扑结构可能存在问题。并且，一般推荐用两种不同的方法构建进化树，如果所得到的进化树类似，则结果较为可靠。

三、软件的选择

表1中列出了一些与构建分子进化树相关的软件。

构建NJ树，可以用PHYLIP（写得有点问题，例如比较慢，并且Bootstrap检验不方便）或者MEGA。MEGA是Nei开发的方法并设计的图形化的软件，使用非常方便。作者推荐MEGA软件为初学者的首选。虽然多雪列比对工具ClustalW/X自带了一个NJ的建树程序，但是该程序只有p-distance模型，而且构建的树不够准确，一般不用来构建进化树。

构建MP树，最好的工具是PAUP，但该程序属于商业软件，并不对学术免费。因此，作者并不建议使用PAUP。而MEGA和PHYLIP也可以用来构建进化树。这里，作者推荐使用MEGA来构建MP树。理由是，MEGA是图形化的软件，使用方便，而PHYLIP则是命令行格式的软件，使用较为繁琐。对于近缘序列的进化树构建，MP方法几乎是最好的。

构建ML树可以使用PHYML，速度最快。或者使用Tree-puzzle，速度也较快，并且该程序做蛋白质序列的进化树效果比较好。而PAML则并不适合构建进化树。ML的模型选择是看构出的树的likelihood值，从参数少，简单的模型试起，到likelihood值最大为止。ML也可以使用PAUP或者PHYLIP来构建。这里作者推荐的工具是BioEdit。BioEdit集成了一些PHYLIP的程序，用来构建进化树。Tree-puzzle是另外一个不错的选择，不过该程序是命令行格式的，需要学习DOS命令。PHYML的不足之处是没有win32的版本，只有适用于64位的版本，因此不推荐使用。值得注意的是，构建ML树，不需要事先的多序列比对，而直接使用FASTA格式的序列即可。

贝叶斯的算法以MrBayes为代表，不过速度较慢。一般的进化树分析中较少应用。由于该方法需要很多背景的知识，这里不作介绍。

表1 构建分子进化树相关的软件

软件 网址 说明

[color=red]ClustalX[/color] [url=http://bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/]http://bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/[/url] 图形化的多序列比对工具

[color=black]ClustalW[/color] [url=http://www.cf.ac.uk/biosi/research/biosoft/Downloads/clustalw.html]http://www.cf.ac.uk/biosi/research/biosoft/Downloads/clustalw.html[/url] 命令行格式的多序列比对工具

[color=red]GeneDoc[/color] [url=http://www.psc.edu/biomed/genedoc/]http://www.psc.edu/biomed/genedoc/[/url] 多序列比对结果的美化工具（可以导入fasta格式的文件，出来的图可用于发表，我用过）

[color=red]BioEdit[/color] [url=http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html]http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html[/url] 序列分析的综合工具

[color=red]MEGA[/color] [url=http://www.megasoftware.net/]http://www.megasoftware.net/[/url] 图形化、集成的进化分析工具，不包括ML

PAUP [url=http://paup.csit.fsu.edu/]http://paup.csit.fsu.edu/[/url] 商业软件，集成的进化分析工具

[color=red]PHYLIP[/color] [url=http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html]http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html[/url] 免费的、集成的进化分析工具

PHYML [url=http://atgc.lirmm.fr/phyml/]http://atgc.lirmm.fr/phyml/[/url] 最快的ML建树工具

PAML [url=http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html]http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html[/url] ML建树工具

Tree-puzzle [url=http://www.tree-puzzle.de/]http://www.tree-puzzle.de/[/url] 较快的ML建树工具

MrBayes [url=http://mrbayes.csit.fsu.edu/]http://mrbayes.csit.fsu.edu/[/url] 基于贝叶斯方法的建树工具

MAC5 [url=http://www.agapow.net/software/mac5/]http://www.agapow.net/software/mac5/[/url] 基于贝叶斯方法的建树工具

[color=red]TreeView[/color] [url=http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html]http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html[/url] 进化树显示工具

（[color=red]加红色标注的为最通用的分析软件[/color]）

需要注意的几个问题是，其一，如果对核酸序列进行分析，并且是CDS编码区的核酸序列，一般需要将核酸序列分别先翻译成氨基酸序列，进行比对，然后再对应到核酸序列上。这一流程可以通过MEGA 3.0以后的版本实现。MEGA3现在允许两条核苷酸，先翻成蛋白序列比对之后再倒回去，做后续计算。其二，无论是核酸序列还是蛋白序列，一般应当先做成FASTA格式。FASTA格式的序列，第一行由符号“>”开头，后面跟着序列的名称，可以自定义，例如user1，protein1等等。将所有的FASTA格式的序列存放在同一个文件中。文件的编辑可用Windows自带的记事本工具，或者EditPlus（google搜索可得）来操作。文件格式如图1所示：

图1 FASTA格式的序列

另外，构建NJ或者MP树需要先将序列做多序列比对的处理。作者推荐使用ClustalX进行多序列比对的分析。多序列比对的结果有时需要后续处理并应用于文章中，这里作者推荐使用GeneDoc工具。而构建ML树则不需要预先的多序列比对。

因此，作者推荐的软件组合为：[color=red]MEGA 3.1 + ClustalX + GeneDoc + BioEdit[/color]。

四、数据分析及结果推断

一般碰到的几类问题是，（1）推断基因/蛋白的功能；（2）基因/蛋白家族分类；（3）计算基因分化的年代。关于这方面的文献非常多，这里作者仅做简要的介绍。

推断基因/蛋白的功能，一般先用BLAST工具搜索同一物种中与不同物种的同源序列，这包括直向同源物（ortholog）和旁系同源物（paralog）。如何界定这两种同源物，网上有很多详细的介绍，这里不作讨论。然后得到这些同源物的序列，做成FASTA格式的文件。一般通过NJ构建进化树，并且进行Bootstrap分析所得到的结果已足够。如果序列近缘，可以再使用MP构建进化树，进行比较。如果序列较远源，则可以做ML树比较。使用两种方法得到的树，如果差别不大，并且Bootstrap总体较高，则得到的进化树较为可靠。

基因/蛋白家族分类。这方面可以细分为两个问题。一是对一个大的家族进行分类，另一个就是将特定的一个或多个基因/蛋白定位到已知的大的家族上，看看属于哪个亚家族。例如，对驱动蛋白（kinesin）超家族进行分类，属于第一个问题。而假如得到一个新的驱动蛋白的序列，想分析该序列究竟属于驱动蛋白超家族的14个亚家族中的哪一个，则属于后一个问题。这里，一般不推荐使用MP的方法。大多数的基因/蛋白家族起源较早，序列分化程度较大，相互之间较为远源。这里一般使用NJ、ME或者ML的方法。 计算基因分化的年代。这个一般需要知道物种的核苷酸替代率。常见物种的核苷酸替代率需要查找相关的文献。这里不作过多的介绍。一般对于这样的问题，序列多数是近缘的，选择NJ或者MP即可。

如果使用MEGA进行分析，选项中有一项是“Gaps/Missing Data”，一般选择“Pairwise Deletion”。其他多数的选项保持缺省的参数。

五、总结

在实用中，只要方法、模型合理，建出的树都有意义，可以任意选择自己认为好一个。最重要的问题是：你需要解决什么样的问题？如果分析的结果能够解决你现有的问题，那么，这样的分析足够了。因此，在做进化分析前，可能需要很好的考虑一下自己的问题所在，这样所作的分析才有针对性。

六、致谢

本文由mediocrebeing在2005年9月8日所发起的讨论《关于建树的经验》扩充、修改而来。文章的作者按原贴ID出现先后排名，由lylover执笔。作者同时感谢所有参与讨论的战友。作者lylover感谢中国科大细胞动力学实验室的金长江博士所给的一些有益的建议。

几个进化树分析及其相关软件的使用和应用范围

大家好：

我在此介绍几个进化树分析及其相关软件的使用和应用范围。这几个软件分别是PHYLIP、

PUZZLE、PAUP、TREEVIEW、CLUSTALX和PHYLO-WIN（LINUX）。

在介绍软件之前，我先简要地叙述一下有关进化树分析的一些方法学问题。

进化树也称种系树，英文名叫“Phyligenetic tree”。对于一个完整的进化树分析需要以下几个步骤：⑴ 要对所分析的多序列目标进行排列（To align sequences）。做ALIGNMENT的软件很多，最经常使用的有CLUSTALX和CLUSTALW，前者是在WINDOW下的而后者是在DOS下的。⑵ 要构建一个进化树（To reconstrut phyligenetic tree）。构建进化树的算法主要分为两类：独立元素法（discrete character methods）和距离依靠法（distance methods）。所谓独立元素法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的（例如：一个序列上可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了）。而距离依靠法是指进化树的拓扑形状由两两序列的进化距离决定的。进化树枝条的长度代表着进化距离。独立元素法包括最大简约性法（Maximum Parsimony methods）和最大可能性法（Maximum Likelihood methods）；距离依靠法包括除权配对法（UPGMAM）和邻位相连法（Neighbor-joining）。⑶ 对进化树进行评估。主要采用Bootstraping法。进化树的构建是一个统计学问题。我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟。如果我们采用了一个适当的方法，那么所构建的进化树就会接近真实的“进化树”。模拟的进化树需要一种数学方法来对其进行评估。不同的算法有不同的适用目标。一般来说，最大简约性法适用于符合以下条件的多序列：i 所要比较的序列的碱基差别小，ii 对于序列上的每一个碱基有近似相等的变异率，iii 没有过多的颠换/转换的倾向，iv 所检验的序列的碱基数目较多（大于几千个碱基）；用最大可能性法分析序列则不需以上的诸多条件，但是此种方法计算极其耗时。如果分析的序列较多，有可能要花上几天的时间才能计算完毕。UPGMAM

（Unweighted pair group method with arithmetic mean）假设在进化过程中所有核苷酸/氨基酸都有相同的变异率，也就是存在着一个分子钟。这种算法得到的进化树相对来说不是很准确，现在已经很少使用。邻位相连法是一个经常被使用的算法，它构建的进化树相对准确，而且计算快捷。其缺点是序列上的所有位点都被同等对待，而且，所分析的序列的进化距离不能太大。另外，需要特别指出的是对于一些特定多序列对象来说可能没有任何一个现存算法非常适合它。最好是我们来发展一个更好的算法来解决它。但无疑这是非常难的。我想如果有人能建立这样一个算法的话，那他（她）完全可以在Proc.Natl.Acad.Sci.USA.上发一篇高质量的文章。

下面介绍几个软件的使用。首先是PHYLIP。其是多个软件的压缩包，下载后双击则自动解压。当你解压后就挥发现PHYLIP的功能极其强大，主要包括五个方面的功能软件：i，DNA和蛋白质序列数据的分析软件。ii，序列数据转变成距离数据后，对距离数据分析的软件。 iii，对基因频率和连续的元素分析的软件。iv，把序列的每个碱基/氨基酸独立看待（碱基/氨基酸只有0和1的状态）时，对序列进行分析的软件。v，按照DOLLO简约性算法对序列进行分析的软件。vi，绘制和修改进化树的软件。在此，我主要对前两种功能软件进行说明。

我们现在有几个序列如下：

Mo3 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGCACGGTACCAT

Mo5 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT

Mo6 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT

Mo7 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCAT

Mo8 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCAT

Mo9 ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT

Mo12 ATGTATTTCGTACATTACTG CCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT Mo13 ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT

要对这8个序列进行进化树分析，按照上面的步骤，首先用CLUSTALX排列序列，输出格式为 *.PHY。用记事本打开如下图：

图中的8和50分别表示8个序列和每个序列有50个碱基。然后，打开软件SEQBOOT，如下图：

按路径输入刚才生成的 *.PHY文件，并在Random number seed (must be odd) ?的下面输入一个4N+1的数字后，屏幕显示如下：

图中的D、J、R、I、O、1、2代表可选择的选项，键入这些字母，程序的条件就会发生改变。D选项无须改变。J选项有三种条件可以选择，分别是Bootstrap、Jackknife和Permute。文章上面提到用Bootstraping法对进化树进行评估，所谓Bootstraping法就是从整个序列的碱基（氨基酸）中任意选取一半，剩下的一半序列随机补齐组成一个新的序列。这样，一个序列就可以变成了许多序列。一个多序列组也就可以变成许多个多序列组。根据某种算法（最大简约性法、最大可能性法、除权配对法或邻位相连法）每个多序列组都可以生成一个进化树。将生成的许多进化树进行比较，按照多数规则（majority-rule）我们就会得到一个最“逼真”的进化树。Jackknife则是另外一种随机选取序列的方法。它与Bootstrap法的区别是不将剩下的一半序列补齐，只生成一个缩短了一半的新序列。Permute是另外一种取样方法，其目的与Bootstrap和Jackknife法不同，这里不再介绍。R选项让使用者输入republicate的数目。所谓republicate就是用Bootstrap法生成的一个多序列组。根据多序列中所含的序列的数目的不同可以选取不同的republicate。当我们设置好条件后，键入Y按回车。得到一个文件outfile

Outfile用记事本打开如下：

这个文件包括了100个republicate。

打开DNAPARS（最大简约性法）或DNAML（最大可能性法）软件。将刚才生成的outfile文件更名后输入。如下图：

选项O是让使用者设定一个序列作为outgroup。一般选择一个亲缘关系与所分析序列组很接近的序列作为outgroup（本例子不选outgroup），outgroup选择的好坏将直接影响到最后的进化树的好坏。选项M是输入刚才设置的republicate的数目。设置好条件后，键入Y按回车。生成两个文件outfile和treefile。

Outfile打开如下图：

该文件包括了227个进化树。Treefile可以用TREEVIEW软件打开同样包含了这227个进化树。

打开CONSENSE软件，将刚才生成的treefile文件更名后输入。如下图：

键入Y按回车。生成两个文件outfile和treefile。Treefile用TREEVIEW打开，如下图：

Outfile打开如下图：

我们看出两个树是同样的。但在outfile的树上的数字表示该枝条的Bootstrap支持率（除以100.6）。到现在，8个序列的进化树分析（最大简约法）已经完成。

如果要用邻位相连法对这8个序列进行分析的话，也首先执行SEQBOOT软件将这8个序

列变成100个republicate。然后，打开DNADIST软件，把SEQBOOT生成的文件输入，如下图：

选项D有四种距离模式可以选择，分别是Kimura 2-parameter、Jin/Nei、Maximum-likelihood和Jukes-Cantor。选项T一般键入一个15-30之间的数字。选项M键入100。运行后生成文件如下图：

这个文件包含了与输入文件相同的100个republicate，只不过每个republicate是以两两序列的进化距离来表示。文件中的每个republicate都省略了第一排的

Mo3 Mo5 Mo6 Mo7 Mo8 Mo9 Mo12 Mo13。以这个输出文件为输入文件，执行NEIGHBOR软件。如下图：

选项M键入100。生成两个文件outfile和treefile用记事本和TREEVIEW打开后，发现这两个文件都含有100个进化树。再将treefile文件更名后输入CONSENSE软件，又得到两个文件outfile和treefile，这就是最后的结果。以上是对DNA序列的分析，如果要对蛋白质序列进行分析，PROTDIST、PROTPARS等软件。其他软件的用法可以参照PHYLIP的

document.。

下面介绍PUZZLE软件。它是用最大可能性的方法来构建进化树的一个软件，并且对树进行bootstrap评估。该软件搜寻进化树时用的算法是quartet puzzling，这个算法相对较快，但如要分析的序列较多时，也相当耗时。另有LINUX版，运行起来相对较快。PUZZLE的输入格式为PHYLIP INTERLEAVED。CLUSTAL可以生成此格式文件。PUZZLE的界面与PHYLIP类似，也是MS-DOS下的软件。

PHYLO-WIN是LINUX下的一个软件。界面友好，极易操作。该界面如下图：

Puzzle: http//:www.tree-puzzle.de

Phylo-win: http//:www.evolution.bmc.uu.se

Phylip、Treeview and Clustalx: http//:biosoft.yeah.net

编者注：该文在一个word文件中，没有署名，这里写的文章作者是根据word属性中的作者署名。

系统发育树构建软件PHYLIP使用说明

一、获取序列

一般自己通过测序得到一段序列（已知或未知的都可以），通过NCBI的BLAST获取相似性较高的一组序列，下载保存为FASTA格式。用BIOEDIT等软件编辑序列名称，注意PHYLIP在DOS下运行，文件名不能超过10位，超过的会自动截留前面10位。

二、多序列比对

目前一般应用CLASTAL X进行，注意输出格式选用PHY格式。生成的指导树文件（DND文件）可以直接用TREEVIEW打开编辑，形式上和最终生成的进化树类似，但是注意不是真正的进化树。

三、构建进化树

1.N-J法建树

依次应用PHYLIP软件中的SEQBOOT.EXE、DNADIST.EXE、NEIGHBOR.EXE和CONSENSE.EXE打开。具体步骤如下：

（1）打开seqboot.exe

输入文件名：输入你用CLASTAL X生成的PHY文件（*.phy）。

R为bootstrap的次数，一般为1000 （设你输入的值为M，即下两步DNADIST.EXE、NEIGHBOR.EXE中的M值也为1000）

odd number: (4N+1)(eg: 1、5、9…)

改好了y

得到outfile（在phylip文件夹内）

改名为2

（2）打开Dnadist.EXE

输入2

修改M值，再按D，然后输入1000（M值）

y

得到outfile（在phylip文件夹内）

改名为3

（3）打开Neighboor.EXE

输入3

M=1000（M值）

按Y

得到outfile和outtree（在phylip文件夹内）

改outtree为4，outfile改为402

(4)打开consense.exe

输入4

y

得到outfile和outtree（在phylip文件夹内）

Outfile可以改为*.txt文件，用记事本打开阅读。

四、进化树编辑和阅读

outtree可改为*.tre文件，直接双击在treeview里看；也可以不改文件扩展名，直接用treeview、PHYLODRAW、NJPLOT等软件打开编辑。TREEVIEW可以显示BOOTSTRAN值，序列较多（60条以上）的时候打开直接显示有明显的重叠，可以在打印预览中显示，或输出为EMF WMF图片文件看，但是序列较多时BOOTSTRAN值的显示位置比较乱，和序列名称有重叠。

PHYLODRAW的编辑功能较强，可以自由调节X、Y轴的长度。输出格式为BMP、PS格式。缺点是不能直接显示BOOTSTRAN值，包括打开TREEVIEW输出的NEX文件，而且输出的BMP文件不全，类似截屏文件，我用PHOTOSHOP进行拼接合成，添加BOOTSTRAN值和注解符号等。据说也可以将PS文件用记事本打开，改变其中的字号，然后通过ADOBE DISTRILLOR将PS转化为PDF，就可以解决问题。如果发现还有重叠，可以再次改变PS文件中的字号大小，直到合适为止。

NJPLOT可以显示BOOTSTRAN值和分值长度。但是不能调节图片X、Y轴的长度。

建MP,ML树将Dnadist和Neighboot两步分别改为Dnapars和Dnaml，其余步骤相同。据说ML法序列较多是非常耗时，我没有尝试。因为我的序列较多。

也可以用CLASTAL X中的BOOTSTRAN N-J TREE法生成进化树，TREE菜单输出格式选项（OUTPUT FORMAT OPTION）中的BOOTSTRAN LABELS ON 选NODE（节点）。在treeview里，选择tree菜单 ,然后把show internal edge lables 的选项打勾了，直

接打开生成的文件bootstrap的值就可以显示出来。