细胞工程在细胞融合技术上的应用

摘 要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项 心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用，使细胞融合的方法和手段向操作更为简便，便于量化研究，同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。

关键词： 方法 动物细胞融合 植物细胞融合 应用

1. 细胞融合常用的技术

1.1生物法

仙台病毒HVJ 诱导法

1962年日本的冈田善雄偶然发现了由日本血凝性病毒HVJ 或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象+ 冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础, 细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视。 1.2化学法

1.2.1盐类融合法

此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率, 使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。

1.2.2高钙和高pH 值融合法

Keller首先发现高Ca2+和高pH 值可以诱发融合。Melchers 用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。

1.2.2聚乙二醇融合法(PEG法)

加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制, 活性稳定, 用PEG 作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG 诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。

1.3物理法

1.3.1电脉冲诱导细胞融合技术

电脉冲诱导细胞融合技术, 产生于20世纪80年代, 目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高, 是PEG 的100倍, 操作简便、快速, 对细胞无毒无害, 可在显微镜下观察融合全过程[6]。

1.3.2激光融合技术

1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合, 从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。该法可选择任意两个细胞进行融合, 易于实现特异性细胞融合, 作用于细胞的应力小, 定时定位性强, 损伤小, 参数易于控制, 操作方便, 可利用监控器清晰地观察整个融合过程, 实验重复性好, 无菌无毒性, 但它只能逐一处理细胞。

2细胞融合技术的最新进展

2..1基于微流控芯片的细胞融合技术

随着微机电系统mems 技术和微加工技术的发展，微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之上，这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台，利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞. 目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域。

优点：基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，比如转移、定位、变形等，也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞，细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现.

缺点：由于在微通道内的腔体容积很小，所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高.

2.2高通量细胞融合芯片

高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在微米范围内（0~40um）产生的高强度、高梯度辐射电场，使得细胞在特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的目标细胞，从而使目标细胞按照预先设计的方向（可以是任何预先设计好的方向）以预定的速度（可以是不同种的细胞以不同的速度定向）移动，从而按照设计要求准确地、大批量地得到目标细胞配型，集成微电极阵列的微流控系统，可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移. 由于在微通道内微电极间距可以做得很小，因此获得同样强度的辐射电场强度只需施加较低电压的交变电场和脉冲即可，不用加载昂贵的高电压发生装置例如, 在20um 的电极对间距施加14 V 的脉冲就相应地可以获得7 kV/cm 的高强度场强, 这足以形成细胞融合所需要的电场强度。

高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合，比如：在细胞融合缓冲液中加入少量的peg 可大大提高细胞的融合率. 此外，二价阳离子以及蛋白酶对细胞进行预处理，融合率也可大幅提高$ 然而，截至目前各国与此相关的细胞融合实验工作只有几篇文章见诸报端，许多构想也只是在理论层次上的探讨$

2.3空间细胞融合技术

由于地球引力的存在，有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞间的融合得率十分有限. 在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，由于无法排除地球引力的影响，要提高淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难世纪’9 年代以来，人们在空间材料科学的启发下，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术. 大量的飞行实验结果表明，在微重力条件下酵母细胞的融合得率有很大的增加，融合得率增加主要是由于降低了重力沉降影响，而杂种细胞的活力增加可能是由细胞排列时间缩短引起的. 在取得这些成功实验的基础上，进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性已经具备.

2.4离子束细胞融合技术

雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体，20世纪80年代中期，中国科学院等离子体物理研究所的余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系. 在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变. 据此原理，发展了离子束诱导细胞融合技术。

此项研究一旦成功，将改变传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大减少筛选的工作量，将是细胞融合研

究的一大进步.

2.5非对称细胞融合技术

非对称细胞融合技术，是利用某种外界因素- 常为：射线，辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核，并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G 处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体，选择性地使其细胞质失活. 然后融合来自这2个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。

3. 细胞融合技术的应用

3.1动物细胞融合技术的应用

3.1.1用于基因定位和绘制人类基因图谱

JP2 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise 和Green 发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ruddle 等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。

3.1.2

一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答反应，树突状细胞（dendritic cells,DCs ）与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，无论是在动物研究还是在人体早期临床试验中都证明这是一种方便、安全、可行的方法[4]。并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的免疫应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫。肿瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式与DCs 结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs 中，使其内源性地表达抗原，这两种方法在抗肿瘤免疫应答中均有效[5-9]，但适于免疫的肿瘤抗原及其基因难以鉴定从而限制了其应用[2]，有实验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的免疫原性不及肿瘤细胞与树突状细胞直接融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs 和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给免疫系统，今后肿瘤疫苗的研究工作将集中在疫苗的纯化上，以期用高度纯化的杂合细胞来激发更为有效和强烈的免疫应答反应，使得这种方法在临床应用中更为实际[10-11]。

3.1.3

用于生产单克隆

使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体（monoclonal

antibody,McAb ）的杂交瘤细胞，单克隆抗体具有专一性和灵敏性，作为理论研究的工具在病原检测和疾病治疗以及食品安全领域具有广阔的应用前景。1985年，中科院上海细胞生物学研究所研制成功抗北京鸭红细胞和淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体，同时还与有关医学部门合作，成功地制备了抗人肝癌和肺癌的单

克隆抗体。在神舟四号上我国自制的细胞电融合仪分别进行了植物细胞的电融合试验和动物细胞的电融合试验，动物细胞电融合实验采用纯化的乙肝疫苗病毒表面抗原免疫的小鼠B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞，目的是获得乙肝单克隆抗体。目前有关单位利用McAb

作用的专一性这一特点正在探索用“生物导弹”对癌症进行

3.1.4

体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer technique,SCNT）是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术打下良好的实验基础[1]

3.1.5

SCNT 将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，

并且也避免了宿

3.1.6

(1)用于研究细胞的核质关系和个体发育。20世纪70年代初，诞生了细胞拆合工程。Carter 于1967年发现细胞松弛素B （CB ）能诱发体外培养的小鼠L 细胞的排核作用。Prescott 等1972年首先应用离心术结合CB 分离哺乳类细胞的胞质体获得成功，为研究哺乳类细胞的核、质相互关系、细胞质基因的转移开创了新的途径[12]。异核体和细胞杂合子被用来确定基因调节因子，这些调节因子决定一个细胞表型消失或得以保持以及赋予受体新性状；通过对供体和受体细胞所有细胞特异性基因表达研究，细胞融合有助于人们了解发育，特别是在研究基因编码的可逆性方面。在个体发育过程中，血红蛋白存在着从胚胎型向胎儿型（幼虫）最终向成人型的转换，对这些转换进行研究，除了揭示基因顺序表达的调控机理外，在医学方面也有意义，人们可以部分或全部扭转从胚胎型向胎儿型的转变从而治疗镰刀型贫血病[13]。

（2）用于揭示疾病发生的机制。与其他技术结合使用，细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。例如，细胞融合与免疫荧光，生化分析，电镜技术相结合，Lattanzi G等对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究[14]。

（3）用于膜蛋白动力学研究。细胞融合技术与显微镜技术结合使用被用来研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系，P éter Nagy等的研究发现大型膜蛋白群之间(主要组织相容性复合物major histocompatibility complex,MHC，包括MHC Ⅰ和MHC Ⅱ）发生蛋白质交换，并且群内蛋白之间也发生蛋白移位，小蛋白群之间也存在着蛋白重排现象。

3.2

3.2.1基础理论研究

Yamagishi等设计了一种新的高效原生质体培养体系, 增加了不对称杂交属内种间细胞融合率[16]。可以设想, 细胞融合技术改善后, 可把人参和冬虫夏草的细胞融合产生新的品种, 并具备它们各自特有的药效。

3.2.2改善作物品质

杂种优势现象在生物界普遍存在, 利用这一现象是提高农作物品质和产量的有效途径之一, 即可以利用雄性不育系进行杂交一代种子生产。核基因控制的雄性不育的保持系很难解决, 而细胞质雄性不育的不育系、恢复系和保持系较易通过体细胞杂交短期内得到。

3.2.3培育抗逆植株

Shelley用马铃薯二倍体作亲本经过体细胞杂交得到抗科罗拉多马铃薯甲虫的四倍体体细胞杂种;Bastia 等对耐霜冻的野生种和栽培种进行体细胞杂交, 获得的所有体细胞杂种都比栽培种亲本耐霜冻, 其中有3株比野生种亲本的耐性还高[17]。

3.2.4应用于种质保存和有用物质生产

目前可将各种细胞器、DNA 、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体, 从而有可能引起细胞遗传性的改变, 为某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮提供可行的方法, 还可应用于种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产[18]。

3.3微生物细胞融合技术的应用

微生物细胞融合技术一方面用于生物药品的生产, 包括抗生素、生物活性物质、疫苗等; 另一方面为发酵工业提供优良菌种, 如酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交, 分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。

4. 结语；从目前的研究进展来看, 细胞工程的前景是光明的, 值得提出的是它 建立在生物资源的可循环性上即节约能源, 又有利于保持自然条件。然而对它也应有个清醒而正确的估价。目前除少数产品外， 如某些单抗以外, 大多数项目离表现明显的经济效益和社会效益还有很长一段跪离, 其中涉及两个主要问题, 一是大量基础性的研究和开发有待进一步发展。二是如何将实验室中的成果转为生产力, 这方面必须有工程技术人员的协同工作才能完成。但是也有其不利的一面，如细胞融合的确切机理至今仍不清楚, 融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性, 致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等性状出现, 此外, 细胞融合也存在伦理方面的问题。任何事物都是一把双刃剑:了解细胞与细胞融合的机理有望对诸如细胞凋亡、神经系统发生、肿瘤发生、干细胞生物学等生命现象作出诠释, 对癌症及传染病进行有效的防护和治疗。人体皮肤细胞与动物卵母细胞融合有望克隆出人类胚胎, 用于治疗性克隆研究, 获取人类胚胎干细胞, 再在体外诱导分化, 克隆出人体全身所有组织和器管。

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