蛋白质翻译中的反转运

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蛋白质翻译中的反转运木

秦燕”

（中国科学院生物物理研究所，生物大分子国家重点实验室，北京１００１０１）

摘要在蛋白质的翻译过程中，氨酰－ｔＲＮＡ进入核糖体，解密ｍＲＮＡ上的一个密码子，并带着ｍＲＮＡ向其５’的方向运动，直到空载的ｔＲＮＡ离开核糖体，整个过程ｔＲＮＡ在核糖体内始终沿着一个方向运动．但随着ＬｅｐＡ（ＥＦ４）蛋白的发现和其功能

的明确，ｔＲＮＡ在核糖体内的新运动形式——“反转运”被揭示，即ｔＲＮＡ带着ｍＲＮＡ倒退一步，向其３，的方向运动．通

过对ｔＲＮＡ反向运动生理意义的研究，引发了对蛋白质翻译调控的深入思考．

关键词蛋白质翻译，核糖体，ｔＲＮＡ反转运，ＬｅｐＡ（ＥＦ４）学科分类号Ｑ７１

蛋白质的翻译是中心法则里的第二个核心过程，即ｍＲＮＡ上携带的核苷酸序列（遗传信息）被转化为氨基酸序列（肽链，蛋白质），从而将四元的核

功能上没有任何报道．近期研究发现，ＬｅｐＡ是核糖体作用因子，在延长循环中具有非常独特的功能：催化ｔＲＮＡ的反向转运，使前进中的２ｔＲＮＡ・ｍＲＮＡ三元复合体在核糖体内倒退一步，因此被称为第４个延长因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ

ｆａｃｔｏｒ

酸世界（Ａ，删，Ｇ，Ｃ）转化为二十元的蛋白质世

界（２０个氨基酸）．发生这个转化过程的平台就是

４，ＥＦ４）．

蛋白质的合成工厂——核糖体，它由小、大两个亚

基组成，小亚基负责解密模板（ｍＲＮＡ）上的遗传信息【¨，大亚基催化新生肽链的合成【２】．将两个亚基的功能连接在一起的就是ｔＲＮＡ．

ｔＲＮＡ是翻译过程中模板的识别者和底物的携带者，一方面通过反密码子识别ｍＲＮＡ上的密码子，另一方面通过３’端脂键连接对应的氨基酸，作为肽链合成的底物吲．在翻译过程中，ｔＲＮＡ与

ＥＦ４的发现和ｔＲＮＡ在核糖体内双向性运动特点的揭示，为ｔＲＮＡ的定位和转运对蛋白质翻译过程的高效性和准确性的调控机制开辟了新的思路［６１．

１蛋白质翻译工厂——核糖体

核糖体是一个非常巨大的核酸蛋白复合物，由大、小两个不对称亚基组成，在原核细胞和类似原核的细胞器（如线粒体，叶绿体）中为５０Ｓ大亚基和

３０６０

核糖体发生作用的所有步骤——进入核糖体、在核糖体内的解密、转运以及离开——都是翻译准确性

和高效性的决定因素．

翻译过程的主体是延长循环，帮助ｔＲＮＡ和核糖体发生作用的延长因子是ＥＦ．Ｔｕ（ＥＦｌａ）和ＥＦ．Ｇ（ＥＦ２），前者携带氨酰一ｔＲＮＡ（ａａ—ｔＲＮＡ）进入核糖体，后者催化ｔＲＮＡ向ｍＲＮＡ的５’端转运，保障ｔＲＮＡ准确、快速地行使功能．在一些高等生物中，ｔＲＮＡ离开核糖体还需要ＥＦ３的帮助１４１．

ＬｅｐＡ是个极度保守的蛋白质，存在于几乎所有的原核生物［５１和真核生物的线粒体／叶绿体中，其同源蛋白在序列上也具有高度的一致性【ｑ，但在

Ｓ小亚基组成的７０Ｓ核糖体，在真核细胞中为Ｓ大亚基和４０Ｓ小亚基组成的８０Ｓ核糖体，直

径在２０～３０ｎｍ，分子质量在２．６＂－－４．５Ｍｕ之间（表１）．核糖体的大亚基由２条ｒＲＮＡ和３０～５０个蛋白质组成，小亚基上由ｌ条ｒＲＮＡ和２０～４０个蛋白质组成（表２）．

・国家霞点基础研究发展计划（９７３）（２００６ＣＢ９１０９０３）和国家自然科学基金（３０７７０４３６）资助项目．・・通讯联系人．

Ｔｅｌ：０１０－６４８６９２５０．Ｅ・ｍａｉｌ：ｑｉｎｙ＠ｉｂｐ．ａｃ．ｃｎ

收稿日期：２００８加１．０５，接受口期：２００８－０４．１０

＂９７４＂

生物化学与生物物理进展Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．

２００８；３５（９）

Ｔａｂｌｅ１

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｋｉｎｇｄｏｍｓ

表１不同界生物的核糖体比较

Ｔａｂｌｅ２

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｋｉｎｇｄｏｍｓ

表２不同界生物的核糖体成分比较

２０００年，古菌５０Ｓｍ、原核细胞的３０Ｓ核糖体亚基ｍ】的全原子结构（ａ１１．ａｔｏｍｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）被首次解析．之后，核糖体５０

Ｓ、３０

的精细结构ｆ１刀．

图ｌａ展示了翻译工厂在工作时的全貌：核糖体的小亚基（左）和大亚基（右）结合在一起，一条ｍＲＮＡ穿过核糖体小亚基，两个ｔＲＮＡ（箭头）在大小亚基之间．小亚基（图ｌｂ）的主体是一条１６

Ｓ

Ｓ亚基和ｔＲＮＡ或

ｍＲＮＡ形成的复合物的结构也被解析出来，为解释肽链转移酶的作用原理１１０１、遗传密码的解密［１ｌ】提供了依据．第一个完整核糖体的结构是嗜热杆菌的

７０

ｒＲＮＡ（浅灰色），２０个蛋白质（深灰色）分布在小亚基面向胞浆的一面（溶液面）．大亚基（图ｌｃ）的主体是一条２３

Ｓ

２００５年获得的【・，ｋ分辨率为３．５Ａ的Ｅｃｏｌｉ完整

７０

Ｓｔｌ２】，而第一个模式生物的核糖体完整结构是在Ｓ核糖体．直到２００６年，终于成功获得了７０

Ｓ

ｒＲＮＡ（浅灰色），３０多个蛋白质（深灰色）

Ｓ

分布在大亚基的溶液面，５

ｒＲＮＡ（箭头）在大亚基

核糖体和完全底物即ｍＲＮＡ和ｔＲＮＡ共结晶的全原子结构ｔｔ４～ｚ６］，揭示了生理条件下的核糖体复合物

的顶端．在大小亚基的结合面，主要分布的是

ｒＲＮＡｆ州．

Ｆｉｇ．１

ＡⅡ・ａｔｏｍｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ

ａ

ＺｔｈｅｒｍｏｐｈＵｕｓ７０Ｓｒｉｂｏｓｏｍｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｏｍｐｌｅｘ删

图１嗜热杆菌７０ｓ核糖体功能复合物的原子结构Ｉ蝴

（ａ）７０Ｓ核糖体功能复合物的完整结构．（ｂ）３０Ｓ小亚基．（ｃ）５０

Ｓ大亚基．

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秦燕等：蛋白质翻译中的反转运＂９７５・

ｔＲＮＡ是ｍＲＮＡ上遗传信息的识别者和底物的携带者，从ｔＲＮＡ进入核糖体内到离开核糖体，需经过３个结合位点：Ａ（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ．ｔＲＮＡ）位点、Ｐ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ—ｔＲＮＡ）位点和Ｅ（Ｅｘｉｔ）位点．图１ａ正是从ｔＲＮＡ入口的角度往里看，箭头所指的分子就是在Ｐ位点的肽酰．ｔＲＮＡ．

在蛋白质翻译的过程中，从第一个ｔＲＮＡ（起始

而且是非常重要的作用就是对第一个延长ｔＲＮＡ的选择性．读码框的准确是靠ｍＲＮＡ和ｔＲＮＡ之间的碱基配对来保证的，在起始过程中，ｍＲＮＡ上只有一个密码子（起始密码子）和起始ｔＲＮＡ配对，固定ｍＲＮＡ的作用比延长过程中总有两个ｔＲＮＡ和ｍＲＮＡ配对要小很多，而弥补这一不足的就是ＳＤ．ａｎｔｉＳＤ相互作用．实验结果表明，相对没有ｔｌｗＡ№，ｔＲＮＡ＃‘）进入核糖体开始，到最后一个ｔＲＮＡ离开核糖体完成翻译过程，共分为翻译的起

始、延长、终止３步．其中，在起始和延长过程中，ｔＲＮＡ的准确定位和转位是保障正确阅读读码框的决定因素．

２翻译起始与Ｓｈｉｎｅ．ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）序列

因为蛋白质的翻译是个非常消耗物质和能量的过程，需要严格调控这一过程的启动，所以无论在原核还是真核生物中，起始总是翻译过程的限速步骤，决定一个蛋白质能否被表达出来．起始的能垒主要来自ｍＲＮＡ的高级结构和Ａ位点对第一个来结合的ｔＲＮＡ的选择性【１８Ｊ，而降低这一能垒的酶，就是核糖体．２．１翻译起始

ｍＲＮＡ定位在游离的核糖体小亚基上，起始密码ＡＵＧ被起始ｔＲＮＡｉ（在原核生物中为ｔＲＮＡｒｖ，ｔ，真核生物为ｔＲＮＡｉ№）识别并定位在Ｐ位点上，随后核糖体大亚基结合上来，形成完整的核糖体，标志着一个翻译起始过程的完成．原核生物的翻译起始由３个起始因子协助完成——Ⅱｌ，ＩＦ２和ＩＦ３，分别结合Ａ、Ｐ、Ｅ位点．由于真核生物的表达调控更为复杂，现在已知参与这个过程的蛋白质或复合物为１２个，这个网络如何调控翻译起始的完整过程依然不很清楚【１９．捌．

２．２

ＳＤ序列确保翻译起始的高效性和准确性在原核生物中，ｍＲＮＡ５’端的ＳＤ序列和１６

Ｓ

ｒＲＮＡ

３，端的ａｎｔｉ．ＳＤ序列的互补配对可以大大加

速翻译起始，因为ＳＤ和ａｎｔｉ．ＳＤ的识别引导了ｍＲＮＡ进入正确的待起始状态、使得起始密码ＡＵＧ暴露在Ｐ位点［２１－－２３］．核糖体起始复合物的原子结构表明，随着ＳＤ．ａｎｔｉＳＤ的识别，一方面ｍＲＮＡ的构象将从紧张状态变为Ａ型螺旋，允许Ｅ位点上的密码．反密码相互作用嗍，另～方面，

３０

Ｓ小亚基的头部被固定，从而为Ａ位点ｔＲＮＡ提供了新的空间构象嘲．

除了空间上的作用之外，ＳＤ序列的另一全新

ＳＤ序列的ｍＲＮＡ而言，有ＳＤ序列的ｍＲＮＡ可以完全杜绝ｎｏｎ．ｃｏｇｎａｔｅｔＲＮＡ，并且将ｎｅａｒ—ｃｏｇｎａｔｅ的ｔＲＮＡ的几率降低一半闭．

肽链延长循环是翻译过程的主体，也是翻译中

酶叫做ＬｅｐＡ（ＥＦ４）．当核糖体大亚基结合到带有ｍＲＮＡ、起始即入位．在核糖体内肽酰转移酶中心的催化下，甲

ＬｅｐＡ

Ｌｅｐｇ是大肠杆菌Ｌｅｐ（１ｅａｄｅｒｐｅｐｔｉｄａｓｅ）操纵子白质的长度变化非常小，在最小的生物支原体中为３翻译延长与反转运酶ＬｅｐＡ（ＥＦ４）

最保守的过程，在所有物种中都具有相同的模式．但最新的研究表明，原核生物体系的翻译延长循环

存在更复杂的过程——反向转运，催化这一过程的

３．１翻译中的延长循环

ｔＲＮＡ的小亚基上时，翻译的起始阶段完成，核糖体进入延长循环．接下来，延长因子ＥＦ—Ｔｕ（ＥＦｌａ）携带氨酰．ｔＲＮＡ进入核糖体，反密码子识别密码子，正确解密后，ＥＦ．Ｔｕ（ＥＦｌａ）水解ＧＴＰ、离开核糖体，氨酰．ｔＲＮＡ完全进入核糖体内部的Ａ位点，硫氨酸从ｔＲＮ胪转移到氨酰．ｔＲＮＡ上．然后，延

长因子ＥＦ．Ｇ（ＥＦ２）催化核糖体构象变化，使得Ａ、Ｐ位点的ｔＲＮＡ分别进入Ｐ、Ｅ位点，即转位，ＥＦ．Ｇ水解ＧＴＰ后离开核糖体，完成一个肽链延长循环（图２）．

３．２

上的第一个基因产物，该蛋白质具有极高的保守性，主要表现在４个方面：ａ．其同源蛋白存在于所有已知序列的原核生物（仅一个除外）四和所有已知序列的真核生物的线粒体／叶绿体中．ｂ．该蛋５９８个氨基酸残基，在人中为６４５个氨基酸残基．ｃ．在序列上也具有高度的一致性，甚至高于必需的翻译起始因子ＩＦ３．ｄ．所有的同源蛋白都具有相同的三级结构．所有ＬｅｐＡ同源蛋白的结构预测都显示同样的结果：从Ｎ端到Ｃ端含有５个结构域，前４个结构域存在于已知结构的蛋白质上，而最后一个是ＬｅｐＡ所特有的Ｃ端结构域．而且，前

－９７６＂

生物化学与生物物理进展Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．

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４个结构域，就存在于一种非常重要、结构和功能

研究都非常深入的蛋白质上——ＥＦ．Ｇ（图３ａ）．

ＥＦ．Ｔｕ・ＧＴＰ．氨酰－ｔＲＮＡ三元复合物和ＥＦ．Ｇ的晶体结构（图３ｂ左，中）体现出很强的相似性，也揭示了它们在功能上的相似关系．三元复合物的ＥＦ．Ｔｕ部分（上部，深色）和ＥＦ．Ｇ的结构域Ｉ、Ⅱ（上部，深色）相似，三元复合物的ｔＲＮＡ部分（下部，浅色）和ＥＦ．Ｇ的结构域Ⅲ、Ⅳ、Ｖ（下部，浅色）相似．其中ＥＦ．Ｇ的结构域Ⅳ在催化ｔＲＮＡ转运的过程中有“机械门”的作用［２９１，而这个非常保守的ＬｅｐＡ恰恰缺少了这部分（图３ｂ右），令人无法猜想它的功能．而早期的基因缺失体的报道，也没有发现任何明显的表现型，令ＬｅｐＡ更加成为一个谜［３０１．

３．３

ＬｅｐＡ（ＥＦ４）诱导ｔＲＮＡ的反转运

最近，通过蛋白质体外翻译体系中对ＬｅｐＡ的

研究，它的秘密被渐渐揭开．首先，脚Ａ具有核

糖体依赖的ＧＴＰ水解酶活性，而且和ＥＦ．Ｇ的活性具有相同的效率，说明它很有可能是核糖体作用因子．接下来的嘌呤霉素实验结果，又向阐明它的功能迈进了一步：分别在延长循环的３个主要中间状

态Ｐｉ、ＰＲＥ、ＰＯＳＴ中，对比没有却Ａ和有ｔｚｐＡ

Ｆｉｇ．２

Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｃｙｃｌｅ明

时的嘌呤霉素活性，发现，ＰＯＳＴ状态在ＬｅｐＡ存在时活性消失，反而和Ｐｌ也状态时的结果一样，

图２翻译延长循环聊

３０Ｓ小亚基（核糖体密度图中浅灰色），５０Ｓ大亚基（核糖体密度图中深灰色）．

从而第一次发现ｔｚｐＡ的作用—ＥＦ．Ｇ的反酶活

Ｆｉｇ．３

Ｉｎ

ｓｉｌｉｃｏａｎａｌｙｓｉｓｏｆＬｅｐＡｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＥＦ－Ｇ图３

ＬｅｐＡ和ＥＦ－Ｇ的数据比较

（ａ）Ｌ印Ａ（大肠杆菌）及其真核同源蛋白Ｃｕｆｆ（酵母线粒体）、ＱＳＸＫＭＢ（人线粒体）结构域和ＥＦ－Ｇ结构域的比对．ｔｚｐＡ，ＥＦ－Ｇ，比对结果显

示，ｔｚｐＡ及其同源蛋白都具有ＥＦ－Ｇ的Ｉ、ＩＩ、Ⅲ、Ｖ再加自身特异性的ＣＴＤ的构型．（ｂ）ａａ－ｔＲＮＡ・ＥＦ－Ｔｕ・ＧＴＰ三元复合体（ＰＤＢｌｌｌＤ、

ＥＦ－Ｇ（ＰＤＢｌＷＤＴ）的晶体结构的比较。以及在此基础上构建的Ｌ印Ａ结构模型峨珥．

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・９７７・

性，即将ＰＯＳＴ状态的核糖体复合物变成ＰＲＥ状态（图４）．

这种状态下，又检查了ｔＲＮＡ和ｍＲＮＡ的位置，进一步证实，由于ＬｃｐＡ的存在，已经在Ｐ、Ｅ位点的ｔＲＮＡ的确又回到了Ａ、Ｐ位点．由此，确认了ＬｅｐＡ的功能，它是ＥＦ．Ｇ的反酶，催化前进中的２ｔＲＮＡ・ｍＲＮＡ复合物在核糖体内倒退一步（一个密码子），也第一次描述了ｔＲＮＡ在核糖体内的第二个运动方向：向着ｍＲＮＡ的３’端运动．因此，便将ＬｅｐＡ称为第４个延长因子ＥＦ４（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ

ｆａｃｔｏｒ４１．

３．４

ＬｅｐＡ（ＥＦ４）的生理意义和研究展望

自然为什么需要ＥＦ４７为什么需要ｔＲＮＡ退回

来？而且为什么只在原核系统中需要，真核的翻译工厂就不需要？它的生理意义回答了这些问题．首先，ＥＦ４的超量表达使细胞致死１６，，¨，而体外实验证实大量的ＥＦ４直接抑制蛋白质的合成（图５ａ）ｔ日，当ＥＦ４的分子数为核糖体１／２时，蛋白质的合成几乎停止．但是，当ＥＦ４的分子数为核糖体Ｉ／５时，Ｆｉｇ．４

Ｐｎｒｏｍｙｃｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ

蛋白质合成的高效性和准确性达到了体内生理条件

图４嘌呤霉素反应

山‰ｏ

穹罔８—导

∞

００．１０．２Ｏ．３０．４０．５

Ｍｏｌａｒｒａｔｉｏ

０－ｅｐＡ：７０ｓ）

ｌ∞％

５０％

Ｆｉｇ．５

ＬｅｐＡｅｆｆｅｃｔｓ

０１１

ＧＦＰｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎ

ａ

ｃｏｕｐｌｅｄ

ｔｒａｎｓｃｒ删０１１－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ／ｎ

ｖ／ａｏ

图５

ＬｅｐＡ对体外表达ＧＦＰ蛋白的影响

（ａ）ＬｅｐＡ在体外表达ＧＦＰ体系中逐渐增加时对ＧＦＰ的总表达量（ＳＤＳ胶和曲线图中的◆一◆）和有效量（ｎａｔｉＶｅ胶和曲线图中的▲一▲）的影响．

（ｂ）ＧＰＦ在体外表达体系中遇到Ｍ旷压力时没有酬左图）和有酬右图）的比较．

．９７８・

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下的水平．更重要的是，在诸如Ｍ矿浓度压力等

极端条件下，ＥＦ４的加入大大提高了蛋白质合成的高效性和准确性（图５ｂ）．

Ｍ矿对以核糖核酸为主的核糖体的构象有非常重要的影响，在Ｍ矿浓度压力下，核糖体的柔性和内部的协调性都大大降低，导致ｔＲＮＡ的转运

受阻，无法准确定位到标准的Ａ、Ｐ、Ｅ位点，最终导致读码框出现问题．在这种情况下，由ＥＦ４诱导ｔＲＮＡ倒退，为重新调整转位提供了机会，从而避免了转位中的错误．由此，一个新的延长模型被提出，首次描述ｔＲＮＡ在核糖体的反向运动和催化该运动的因子ＥＦ４（图６）ｔ６１．

Ｆ垭．６

ＭｏｄｅｌｆｏｒＬｅｐＡ（ＥＦ４）ｆｕｎｃｔｉｏｎ

图６新的肽链延长模型

粗箭头所指的循环：在正常的生理条件下ｔＲＮＡ的转运很少出错，不需要ＥＦ４，就可以顺利从Ａ、Ｐ位点（ＰＲＥ状态）进入Ｐ、Ｅ位点（ＰＯＳＴ状态１．这个过程由延长因子ＥＦ毛催化完成．ＥＦ－Ｇ解离以后，Ａ位点窄出来，下一个ａａ－ｔＲＮＡ・ＥＦ－Ｔｕ・ＧＴＰ三元复合物进入，然后Ｅ－ｔＲＮＡ解离．细箭头部分：在某螳情况卜．（比如ＥＦ－Ｇ没有正确行使作用），ｔＲＮＡ转运出错．这样导致２种结果：ａ．读码框移位，或错配，ｂ．使得核糖体上的ｍＲＮＡ通路阻塞，难以继续蛋白质的合成．在这种情况下，ＥＦ４・ＧＴＰ将识别并催化反转运的发生，使得核糖体复合物回到转运前的状态，再给ＥＦ乇一次机会．

ＬｃｐＡ（ＥＦ４）的功能和生理意义的研究结果告诉我们，即便是在原核生物这个相对简单的体系中，蛋白质的翻译不仅在起始阶段存在很强的调控作用，在延长这个阶段同样受到调控，而且这种调控相对真核体系还要复杂．为什么需要这种复杂性？它存在的深层意义和背后的调控又是如何？更多的关于ＥＦ４在翻译机器中的结构和功能的深入研究将逐渐解释这些问题．

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蛋白质翻译中的反转运

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

秦燕， QIN Yan

中国科学院生物物理研究所,生物大分子国家重点实验室,北京100101生物化学与生物物理进展

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相似文献(10条)

1.学位论文 郭鹏 腾冲嗜热菌核糖体再循环因子结构与功能研究 Ⅰ.腾冲嗜热菌核糖体再循环因子的表达，纯化及表征;Ⅱ.采用结构域交换构建嵌合体蛋白的方法研究核糖体再循环因子的结构域功能及分子作用机理;Ⅲ.腾冲嗜热菌核糖体再循环因子C端序列缺失对其结构和功能的影响 2005

本论文主要包括三个方面的工作：第一个工作是对腾冲嗜热菌核糖体再循环因子(RRF)的表达，纯化以及表征；第二个工作采用结构域交换构建嵌合体蛋白的方法研究了RRF的结构域功能及分子作用机理；第三个工作研究了腾冲嗜热菌RRF的C末端序列缺失对其结构和功能的影响。

1.腾冲嗜热菌核糖体再循环因子(RRF)的表达，纯化以及表征：作为原核生物体内必需的蛋白质翻译因子，核糖体再循环因子(RRF)在延伸因子G(EF-G)协助下完成蛋白质翻译的第四步：即翻译终止后复合物—含去酰化tRNA，mRNA和70S核糖体—的解体，核糖体被循环再利用。为了研究RRF蛋白的结构与功能关系，我们对腾冲嗜热菌核糖体再循环因子(TteRRF)进行了克隆，表达，纯化及鉴定。测序结果表明，TteRRF基因全长555bp，编码184个氨基酸残基，与大肠杆菌RRF(EcoRRF)有51.4％的氨基酸序列完全一致，68.1％的序列近似。TteRRF蛋白在大肠杆菌细胞内得到了高效可溶表达，使用金属螯合层析的方法得到了很高的纯度。对TteRRF蛋白进行了一系列的性质测定，包括质谱分析，westernblot，体内活性测定等。质谱分析表明TteRRF的分子量为21488，与EcoRRF十分接近。Westernblot结果表明，TteRRF可以与EcoRRF的多克隆抗体间产生相当的交叉免疫反应。体内活性实验则表明TteRRF在大肠杆菌细胞内有微弱的活性。以上实验结果表明，我们得到了腾冲嗜热菌的核糖体再循环因子(TteRRF)，这为我们下一步以此为模型研究其结构与功能关系奠定了基础。

2.采用结构域交换构建嵌合体蛋白的方法研究RRF的结构域功能及分子作用机理：核糖体再循环因子(RRF)在延伸因子G(EF-G)帮助下解体翻译终止后复合物，完成原核生物体内蛋白质翻译的第四步。RRF分子的三级结构外形与tRNA十分类似，由两个相对独立的结构域组成，但其各自的功能仍不清楚。Nakano等人尝试分别表达RRF的结构域Ⅰ和结构域Ⅱ来检测他们各自的功能，结果发现单独表达的结构域Ⅱ由于是包含体而无法测定其活性；结构域Ⅰ与核糖体的结合位点和完整的RRF相同，但却不具有RRF的活性。为了确定哪个结构域在执行RRF的功能中起着主要作用以及哪个结构域在RRF分子稳定性方面起主要作用，本章中以交换大肠杆菌RRF(EcoRRF)和腾冲嗜热菌RRF(TteRRF)结构域的方法构建了两个蛋白嵌合体EcoDⅠ/TteDⅡ和TteDⅠ/EcoDⅡ，并在大肠杆菌细胞中进行了高效可溶性表达。其中，EcoDⅠ/TteDⅡ含有EcoRRF的结构域Ⅰ和TteRRF的结构域Ⅱ;而TteDⅠ/EcoDⅡ则含有TteRRF的结构域Ⅰ和EcoRRF的结构域Ⅱ。通过体外(invitro)及体内(invivo)活性分析，比较两个嵌合体蛋白和两个野生型蛋白解体翻译终止后复合物的功能，结果发现：在大肠杆菌EF-G(EcoEF-G)存在的条件下，TteDⅠ/EcoDⅡ和EcoRRF一样，表现出了完全的解体翻译终止后复合物的活性。而EcoDⅠ/TteDⅡ与TteRRF一样，都没有表现出或者是表现出较低的解体翻译终止后复合物的功能；然而在与TteEF-G共表达的情况下，他们又表现出较高的活性。与核糖体的结合实验表明四个蛋白都能有效的与核糖体结合，排除了EcoDⅠ/TteDⅡ与TteRRF在大肠杆菌体系中无活性是由于EcoDⅠ/TteDⅡ与TteRRF不与大肠杆菌核糖体结合。而胍变性和热变性实验结果表明，TteDⅠ/EcoDⅡ和TteRRF的变性曲线很接近；EcoDⅠ/TteDⅡ和EcoRRF的变性曲线很接近。以上的实验结果不但表明RRF分子的结构域Ⅱ在RRF功能表达中可能起着重要作用，而且提示RRF和EF-G分子之间存在着特异性相互作用；而结构域Ⅱ可能更多地参与了与EF-G的相互作用。结构域Ⅰ则可能主要负责与核糖体的结合及RRF分子的稳定性。两个蛋白嵌合体EcoDⅠ/TteDⅡ和TteDⅠ/EcoDⅡ可在大肠杆菌细胞中高效可溶性表达的这一事实表明，RRF分子构象的完整性对于其正确的折叠是至关重要的，而domainⅡ的正确折叠可能依赖于与domainⅠ有效地相互作用。本章的工作为鉴定RRF两个结构域各自的功能提供了直接的生化证据。

3.腾冲嗜热菌RRF的C末端序列缺失对其结构和功能的影响：RRF的C-末端序列，二级结构成分是α-螺旋，在其三级结构中属于结构域Ⅰ的组成部分，但在空间上更靠近两个结构域间的铰链区域。由于它所处位置的特殊性，引起了研究者们的注意。Fujiwara等人的研究指出，在特定条件下，嗜热菌ThermusthermophilusRRF(TthRRF)在大肠杆菌细胞内没有活性，但是从其C末端去掉5个氨基酸残基(△C5TthRRF)后却表现出了完全的活性。据此他们提出一个假设，TthRRF的domainα(即结构域Ⅰ)在大肠杆菌细胞内可能有潛在的激活功能，而它的这种功能则是由其C-末端的5个氨基酸残基所调控。故而，他们提出TthRRF的C末端残基是一个调节元件(modulatorelement)。为了证实这一论断，Rao等人利用结核杆菌RRFRRF(MtuRRF)和C末端去掉6个氨基酸残基后的突变体(△C6MtuRRF，与△C5TthRRF缺失的氨基酸残基在序列上是对等的)做了同样的工作，结果发现MtuRRF和它的C末端缺失突变体均不能在大肠杆菌细胞内表现出活性。考虑到结核杆菌是嗜温菌，我们不能简单地用Rao等人的结果否定Fujiwara等人的论断。为了进一步探究这一问题，在此我们用TteRRF作为研究模型。如上所述，与TthRRF相似，在特定条件下TteRRF在大肠杆菌细胞内也没有活性，其C末端缺失6个氨基酸残基对等于TthRRF去掉C末端5个残基。那么，TteRRF的C末端6个残基是不是其在大肠杆菌细胞内发挥活性的调节元件(modulatorelement)呢?其C末端序列对整个RRF分子的完整性，稳定性和功能又有哪些影响呢?为了解答这两个问题，我们构建了TteRRF的4个C末端缺失突变体△C6TteRRF，△C9TteRRF，△C12TteRRF和

△C15TteRRF，其C末端分别缺失了6个，9个，12个和15个氨基酸残基。4个突变体蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)体系中得到了高效可溶性表达。我们利用活性测定，核糖体结合，圆二色(CD)谱，内源荧光，ANS结合荧光，以及胍变性和热变性等方法，研究了C末端序列缺失对TteRRF结构与功能方面的影响。实验结果表明：与TteRRF相比，虽然△C6TteRRF和△C9TteRRF在α-螺旋含量上分别减少了20％和27％，三级结构含量分别减少了10％和¨％；但是结合核糖体的能力以及在大肠杆菌细胞内解体翻译终止后复合物的活性仍接近于TteRRF。而△C12TteRRF和△C15TteRRF的结构完整性和稳定性则明显降低，其二级结构含量分别下降了39％和46％，三级结构含量分别下降了28％和45％；并且完全丧失了与核糖体的结合能力以及在大肠杆菌细胞内解体翻译终止后复合物的活性。由此我们认为：至少C末端前9个氨基酸残基的缺失对TteRRF的结构与功能影响不大，C末端尾巴可能不是TteRRF的活性调节元件(modulatorelement)，至少不具有普遍性。C末端前12个氨基酸残基的缺失使△C12TteRRF的构象发生显著变化，从而导致其失去与核糖体结合的能力。这些结果进一步验证了第二部分工作得出的有关domain工的结论，即domainⅠ主要负责与核糖体的结合；而且我们据此进一步推论，RRF与核糖体的有效结合是其发挥功能的必要前提。

2.期刊论文 唐雅婷.刘克文 核糖体的结构和功能研究——2009年诺贝尔化学奖解读 -中国校外教育（理论）2010(8)

2009年诺贝尔化学奖的获奖者在原子水平上构建起核糖体的晶体结构,揭示了核糖体合成蛋白质的关键机理:肽键生成机理和蛋白质翻译的高精确性.核糖体结构和功能研究对开发新抗生素具有重要的意义,是一项具有重要现实意义的研究.

3.期刊论文 周培.杨力.陈佳.李伯良.赵学明.张耀洲 真核细胞蛋白质翻译起始研究进展 -浙江工程学院学报2004,21(4)

在大量有关机制的研究基础上,针对真核蛋白质翻译起始,提出了核糖体沿mRNA滑动识别翻译起始位点的机制和核糖体从mRNA内部识别翻译起始位点的机制.

4.学位论文 姚展 细胞凋亡的多级分子调控机制 2008

细胞凋亡，是细胞生命终结的重要方式。过多的细胞凋亡和正常水平的凋亡过程的抑制都会导致疾病的发生甚至危及生命。因此，细胞凋亡的发生是受到严密的控制的。从细胞接收到凋亡信号刺激到信号逐级的传递都如同预先设定好的程序一样进行，而这一程序就写在细胞的基因组之中。因为这一调控方式如同生命的其他特征一样是代代相传的，即使在因为长期进化而产生的不同物种之间这一作用途径也具有显著的保守性。

从某种意义上讲，细胞凋亡的通路是通过一系列RNA和蛋白质的合成和加工而实现的。因为在正常情况下，导致细胞凋亡的分子在细胞中是处在低水平和低活性状态的，而抑制细胞凋亡的分子则起主导作用，而在凋亡刺激信号的作用下，这种平衡关系则会被逆转。而导致这一逆转的过程又受到包括转录调控、RNA加工、蛋白质翻译调控、蛋白质翻译后修饰以及蛋白质降解等多种途径的调控，而这里的研究工作就是为了揭示细胞捌亡中的这些多级调控是如何协同作用而决定细胞的命运。

首先，我们鉴定了细胞凋亡的上游信号分子Caspase-8/Mch5上位于两个Death Effector Domain(DED)结构域之间的一个新的自身切割位点，当细胞接收到凋亡信号的刺激时，Caspase-8能通过自身的剪切激活而对该位点进行切割，从而释放出Caspase-8/Mch5蛋白氨基端的肽段DEDa；该活性多肽分子能通过与细胞核．质穿梭蛋白ERK结合而被转运到细胞核内，并通过与p53结合蛋白TOPORS发生相互作用而影响转录因子p53的转录活性，最终引发Caspase-8基因自身的上调。该发现揭示了caspase-8的自身放大正反馈的转录调控途径，为研究细胞凋亡过程中信号网络调控提供了一个新的机制。 同时，上面的工作也提示了细胞核仁在细胞凋亡调控中可能扮演重要角色。通过对细胞核仁中的重要蛋白B23在核仁压力刺激下的动态分布的研究，我们发现，核糖体RNA转录抑制导致的核仁解体会导致B23在细胞质中与hnRNP-U/Al结合。尽管这一结合本身受到特异的结合hnRNP-U的mRNA调控，它同时也会通过调控RNA的加工水平，而影响细胞对核仁压力的响应，而且这一作用机制中hnRNPA1参与的miRNA-18a加工也起着重要作用。降低B23的表达水平或者通过过量表达抑制结合的RNA抑制其与hnRNP-U/A1的结合，都会导致细胞对于Actinomycin引起的核仁压力更加敏感而趋向凋亡。同时这-机制对于细胞周期的调控也有重要作用，抑制B23与hnRNP-U/Al将导致细胞更加难以从细胞周期检验点的持续中逃逸而发生细胞凋亡。姚展最后，我们也尝试通过抗药细胞株的筛选，寻找到一些参与抗药机制的基因。通过对HeLa细胞使用紫杉醇进行筛选，我们成功的分离了一个抗紫杉醇的细胞株，该细胞株对于紫杉醇引起的周期阻断和细胞凋亡都极不敏感，利用microarray对该细胞株的基因表达谱的分析，促使我们发现并鉴定了一个在该细胞株中高表达的抗紫杉醇基因TXR-3，对于其作用机制的研究还在进行之中。

5.学位论文 郭雪艳 人核糖体蛋白S13在胃癌中的表达及功能分析 2007

【背景】人核糖体蛋白S13(RPS13) 基因位于染色体11P15.1－14，全长约3.3Kb,有6 个外显子和5 个内含子。RPS13 是细胞内蛋白质翻译小体－核糖体小亚基上重要的结构蛋白之一，属于核糖体蛋白S15P 蛋白家族，主要定位于细胞浆内。广泛分布于脑、甲状腺、肺、心、乳腺、胃、肝、肾、结肠、胎盘、前列腺和皮肤等组织，在骨髓和胰腺中高表达。在蛋白质翻译过程的多个阶段，RPS13 在调节核糖体大小亚基间相互作用中起非常重要的作用。研究还证实RPS13 蛋白在生长活跃的细胞、结肠癌和非小细胞肺癌中高表达。

前期的研究发现RPS13 在胃癌耐药细胞中表达显著高于胃癌细胞，进一步研究发现RPS13 可能是通过抑制药物诱导细胞凋亡而促进胃癌细胞多药耐药。RT-PCR 结果表明RPS13 在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织，提示RPS13 在胃癌的发生发展中可能发挥重要的作用。

既往的研究表明，核糖体蛋白在肿瘤发生发展的过程中发挥了重要的作用。很多核糖体蛋白，如RPS6、RRPL15 和RPS3a 等都与肿瘤的发生发展密切相关。然而，人核糖体蛋白RPS13 在胃癌中的表达如何，是否与胃癌的发生发展有关尚不清楚，本课题将对此进行深入探讨。 【目的】

1、RPS13 的原核表达，纯化及其多克隆抗体的制备； 2、探讨RPS13 在胃癌组织和细胞中的表达及亚细胞定位； 3、研究RPS13 在胃癌发生发展中可能的作用。 【方法】

1、构建RPS13 原核表达载体并转化入E. coli，IPTG 诱导RPS13融合蛋白的表达； 2、以固化Ni2＋柱纯化目的蛋白；

3、以融合目的蛋白为抗原免疫小鼠制备RPS13 抗血清；

4、RT-PCR 方法和Western blot方法分别检测RPS13 在胃癌细胞系MKN28、AGS、SGC7901、MKN45 及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR 和胃粘膜永生化细胞GES-1 中的表达情况；

5、免疫细胞化学方法证实RPS13 在胃癌细胞SGC7901 和SGC7901/VCR 中的表达和亚细胞定位；

6、免疫组织化学观察RPS13 在胃癌组织和非肿瘤胃粘膜组织中的表达情况，并分析RPS13 的表达与胃癌临床病理资料的关系； 7、构建RPS13 的正义真核表达载体和siRNA 载体，脂质体法转染SGC7901 细胞，G418 筛选并获得稳定克隆； 8、Western blot 方法鉴定不同载体的转染效果； 9、MTT 法绘制细胞生长曲线；

11、平板克隆形成实验观察细胞在体外的克隆形成能力；

12、裸鼠成瘤实验观察RPS13 对胃癌细胞体内的成瘤能力的影响；

13、Western blot 检测转染细胞中经典周期相关分子（Cyclin D1及Cyclin B）的表达。

【结果】

1、RPS13 的原核表达，纯化及其多克隆抗体的制备

（1）成功表达了RPS13 融合蛋白；

（2）用固化Ni2＋亲和层析法得到了纯度很高的融合蛋白；

（3）制备了特异性较高的抗RPS13 多克隆抗体；

2、探讨RPS13 在胃癌组织和细胞中的表达

（1）RPS13 在胃癌细胞系MKN45、SGC7901、MKN28 和AGS 中的表达高于正常胃粘膜永生化细胞GES-1,在耐药细胞SGC7901/VCR 中的表达高于其亲本细胞系；

（2）RPS13 在胃癌细胞SGC7901 中主要分布于胞浆内；

（3）RPS13 在61 例胃癌原发灶癌细胞的胞浆中表达，其阳性率74％(45/61)明显高于非肿瘤胃粘膜组织42％ (10/24)，这一结果提示RPS13 在胃癌组织中高表达( p

（4）发现胃癌组织中RPS13 的过表达与患者年龄、性别和肿瘤的分化程度、TNM 分期及淋巴结的转移均无相关（ p>0.05）。

3、研究RPS13 参与胃癌发生中可能的作用

（1）构建了RPS13 真核正义表达载体和siRNA 载体,将其分别转染胃癌细胞SGC7901，G418 筛选获得稳定表达的混合克隆，Western blot 检测证实成功建立了RPS13 上调和下调的稳定细胞亚系。

（2）用MTT 法检测细胞生长情况，结果发现RPS13 表达上调使细胞生长加快；而下调RPS13 的胃癌细胞生长减慢。

（3）细胞周期检测结果显示，RPS13 上调的细胞增殖指数增加，G1/S 期的转换加快；siRPS13 转染的细胞增殖指数减小，并出现G1 期阻滞。

（4）药物诱导细胞凋亡率检测显示，RPS13 过表达细胞凋亡率明显下降，siRPS13转染的细胞凋亡率上升。

（5）平板克隆试验显示，RPS13 正义转染细胞生长加快，克隆形成率显著高于对照组；siRNA 抑制RPS13 表达的细胞生长减慢，克隆形成率低于转染空载体的细胞。

（6）Western blot 检测经典的周期相关分子发现，RPS13 上调/下调的细胞中Cyclin D1 分子和Cyclin B 的表达均无明显变化。

【结论】

(1)RPS13 在胃癌组织和多种胃癌细胞系中过表达，提示它参与胃癌发生发展。

(2)RPS13 上调可促进胃癌的恶性表型：促进胃癌细胞的生长和成瘤性，可抑制药物诱导的胃癌细胞凋亡；相反，RPS13 下调能抑制胃癌细胞的生长增殖，促进胃癌细胞的凋亡。

(3)RPS13 可能通过参与调节细胞凋亡、细胞周期等多种途径影响胃癌细胞恶性生物学行为，仍需进一步的探索其分子机制。

6.期刊论文 郭晓强.冯志霞 RNA研究领域的女科学大师——斯特恩兹 -生物学通报2009,44(9)

RNA既参与蛋白质的翻译过程,又涉及基因的表达调节,是一种功能广泛的生物大分子.斯特恩兹是RNA研究领域的一位女科学大师,她早期确定了蛋白质翻译起始过程中mR NA和核糖体的识别机制,20世纪70年代末又发现一类小核RNA,并阐明小核RNA在RNA转录后拼接中的作用和与自身免疫性疾病发生的关系.对小核RNA的研究在拓展对RNA功能理解的同时还显示出巨大的临床应用潜力.

7.学位论文 郝占西 大肠杆菌亮氨酸tRNA毫秒级构象变化的NMR研究 2010

在依赖于核糖体的蛋白质生物合成过程中，tRNA为行使接头分子的功能，必须在对应的氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA

synthetase，aaRS，E.C6.1.1)催化作用下于分子的3’末端加载氨基酸，形成蛋白质合成的原料氨基酰-tRNA。aaRS是一类古老的蛋白质，根据不同进化来源的结构特征的催化活性中心，20种aaRs被分为两类，每类有10种，而亮氨酰-tRNA合成酶(Leucyl-tRNA synthetase，LeuRS)属于第一类酶的a亚类。除ArgRS，GInRS和GIuRS是通过一步反应实现tRNA的氨基酰化，大部分aaRS催化的氨基酰化反应分为两步完成。第一步是氨基酸的活化反应：氨基酸攻击ATP的α-磷酸基团，产生被活化的中间体氨基酰-腺甘酸和焦磷酸；该反应又叫ATP-PPi交换反应(磷交换反应)。第二步是tRNA的氨基酰化反应：氨基酸被转移到tRNA的3’-末端腺苷酸的核糖的羟基上产生氨基酰-tRNA和AMP。进一步，氨基酰-tRNA被蛋白质翻译因子运载到核糖体，通过tRNA分子上的反密码子与mRNA上而的密码子进行碱基配对，依次通读每一个三联体密码。这种密码子-反密码子相互作用特异性地决定了蛋白质分子中氨基酸的序列位置。因此，蛋白质生物合成的质量控制主要取决于核糖体上密码子-反密码子碱基配对和tRNA的氨基酰化这两个过程。　　

为保证tRNA氨基酰化的精确性，aaRS必须从化学结构相似的氨基酸中特异性地识别对应的氨基酸，同时也必须从细胞内众多结构相似的tRNA中特异性地识别对应的tRNA。aaRS要做到正确识别对应氨基酸，防止错误识别非对应氨基酸并将错误率控制在蛋白质生物合成可以接受的水平(约为10-4)，主要通过两类机制：优先结合对应氨基酸并对相似氨基酸进行筛选性编校。而aaRS特异性识别对应的tRNA，主要取决于tRNA分子上的识别元件能否被aaRS分子上对应的结构元件识别。　　

三界生物的tRNALeu与tRNASer，tRNASec以及原核类tRNATyr的可变茎环都是由多于10个核苷酸组成，它们一起构成第二类tRNA；而其余的tRNA的可变茎环仅由5～6个核苷酸组成，统称为第一类RNA。在tRNALeu的氨基酰化过程中，由于细胞内存在许多与亮氨酸侧链结构十分相似的氨基酸，LeuRS很难将亮氨酸与相似氨基酸区分开来，因而在进化过程中LeuRS通过基因融合获得了具有水解活力的含编校活性中心的结构域以阻止tRNALeu的误氨基酰化。在整个编校过程中离不开tRNALeu的参与，tRNALeu3’末端在合成活性中心和编校活性中心之间的“穿梭”转位是发挥编校功能的关键步骤。尽管不同系统来源的tRNALeu的识别元件各不相同，但是辨别子A73和三级碱基对是它们的主要识别元件。　　

tRNALeu的识别元件能否表现正确的动态构象从而被LeuRS对应的结构元件最为有效地识别，对于精确合成亮氨酰-tRNA乃至蛋白质至关重要。而表现的动态构象主要决定于在毫秒级的tRNALeu分子构象变化。我们利用核磁共振波谱学(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)技术，研究了E.coli tRNALeu的热稳定性，并通过测定镁离子依赖的碱基对中的亚氨基质子与水分子中氢原子交换的速率，重点对毫秒级tRNALeu的构象变化进行了分析。结果表明，E.coli tRNALeu(CAG)的热稳定性随着镁离子浓度和pH值的升高而增加。而在[Mg2+]/[tRNALeu]从1增加到5，10和15的过程中，tRNALeu各个碱基对构象变化的转变趋势和转变步骤都各不相同。其中，在与后续生化功能实验结果对应的[Mg2+]/[tRNALeu]由10增加到15的过程中，只有接受茎5’末端前三位碱基对中亚氨基质子与水分子中氢原子交换的速率(均为毫秒级)显著增加；而相应地，反映稳定性变化的接受茎前三位碱基对的自山能变化的差值均为负值。这就表明接受茎5’末端前三位碱基对的构象变化加剧，局部结构变得灵活。进一步，通过酶活力测定实验和NMR滴定实验，我们研究了大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli) tRNALeu的毫秒级构象变化对LeuRS氨基酰化与编校反应的影响。结果表明，LeuRS氨基酰化活力受镁离子依赖的E.colitRNALeu毫秒级构象变化的影响，而转移后编校活力基本不受影响。接受茎5’末端前3对碱基对在这一过程中发挥重要作用并且CCA末端在大多数时间内指向编校活性中心。

8.期刊论文 胡永林.HU Yong-Lin 核糖体的结构与功能研究——2009年诺贝尔化学奖简介 -生物化学与生物物理进展2009,36(10)

一系列高分辨率的核糖体及其30 S、50 S亚基的晶体结构揭示了这个极其复杂的蛋白质翻译机器的重要作用机理,对在分子水平上了解生命机体产生和形成的一个基本环节(蛋白质合成)具有重大意义,同时为新型抗生素的设计与研发开辟了新方向新途径,对人类健康与生命保障具有重要作用.

9.学位论文 魏旭斌 香樟树种子中兼性超氧化物歧化酶的纯化及其酶活性的研究 2003

1.从樟树种子中分离纯化出均一程度的一种兼性SOD.用NBS对SOD进行化学修饰之后,同时引起歧化酶活性与切割DNA酶活性发生同步的变化,说明这两种酶活性由相同分子机制所决定:色氨酸在其中起重要作用.这些发现丰富了SOD酶在机体的功能的多样性,具有重要的生理学意义.2.植物来源的核糖体失活蛋白是一类非特异性的抑制蛋白质合成的蛋白质毒素.3.真核生物延伸因子2是一种结合在核糖体上在蛋白质翻译过程中催化肽酰tRNA从A位点向P位点转位的蛋白因子.

10.学位论文 胡欣 水稻4号染色体长臂74.5～78.2cM区段的基因注解以及水稻两组基因frr和trs的结构与功能研究

2004

基于水稻两个亚种indica与japonica已被证实的高度共线性,在该中心1997年构建的第一代水稻基因组物理图的基础上,结合指纹法、分子标记锚标定位STC-PCR等技术,构建了构建了水稻籼稻广陆矮4号(GLA4)与粳稻日本晴(Nipponbare)4号染色体的物理图,并据此最终完成了Nipponbare 4号染色体的精确测序工作.完成序列(finished sequence)全长34.6 Mb,覆盖染色体的97.3％.使用基因中心自主开发的基因组注解软件包对Nipponbare 4号染色体长臂中段74.5~78.2 cM、全长1946125 bp的区段进行了基因预测和人工修正,确认预测基因297个,其中包括8个known基因,52个novel基因,134个putative基因及103个hypothetical基因.基因的平均长度2764 bp,平均外显子数目5.4个.根据上述基因注解结果并结合同源数据搜索,我们发现并实验验证了水稻中的两组表达基因——frr和trs.其中,frr具有两个同源基因——位于4号染色体上的OsfrrA和7号染色体上的OsfrrB.frr编码的核糖体再循环因子(Ribosome Recycling Factor,RRF)在原核生物的蛋白质合成系统中起着不可或缺的作用:帮助翻译后复合体的解聚,并且避免翻译错误,因此是除了古细菌外所有基因组己被研究的原核生物中均有的一个高度保守的基因.OsfrrA和OsfrrB在基因组中都是单拷贝的,分别编码260个氨基酸残基的OsRRFA和242个氨基酸残基的OsRRFB.根据OsRRFA与OsRRFB不同的N端特性、在不同组织和时期的转录谱及与其它35个原核和真核RRF的同源比较,我们推断,OsRRFA和OsRRFB虽然由核基因编码,但将被分别转运并定位于线粒体和叶绿体中,并在其蛋白质翻译系统中发挥与其在原核生物中相似的功能.鉴于水稻线粒体与叶绿体基因组中并没有发现这两个基因的同源序列,因此有理由相信它们是在进化的过程中从细胞器基因组转移到核基因组中的.对从GeneBank中搜集到的37个涵盖了各类己进行了基因组研究的原核生物及有限的几个真核生物的RRF的进化分析结果还揭示了RRF在分子进化研究中作为标尺的潜在价值.

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下载时间：2011年2月16日