植物生理生化指标测定

小黑豆相关生理指标测定

1. 表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积

鲜重：取处理好的植株，擦干根和叶表面水分，测量整株植物的重量，每个测6个重复。

株高：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度，记录，每个测6个重复。

主根长：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测6个重复。

叶面积：取处理好的植株，选择第二节段的叶片，测量叶面积，叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测6个重复。

2. 总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA ）和H2O2含量测定

样品处理：取0.5g 样品（叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净），速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml 的Tris-HCl （pH7.4）抽提，将抽提液转移到2ml 的EP 管中，于4℃，12000rpm 离心15min ，取上清，保存在-20℃下，上清液可用于总蛋白、丙二醛（MDA ）、可溶性糖和H2O2含量测定。

总蛋白测定（Bradford 法）：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品），空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford ）。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X 代表OD595) ，计算得出蛋白含量。

可溶性糖测定：样品反应体系（1ml 蒽酮+180ul ddH2O+20ul样品提取液）；空白对照（1ml 蒽酮+180ul ddH2O ），测定OD625后带入标准曲线：Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625，X 代表可溶性糖含量（ug ）)

蒽酮配方：称取100mg 蒽酮溶于100ml 稀硫酸（76ml 浓硫酸+30mlH2O）. 注意：浓硫酸加入水中时，一点一点递加，小心溅出受伤。

丙二醛（MDA ）测定：在酸性和高温条件下，丙二醛可与硫代巴比妥（TBA ）反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm 处有最大吸收波长，但该反应受可溶性糖的极大干扰，糖与TBA 的反应产物在532nm 处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm 处。采用双组分分光光度法，可计算出MDA 含量。MDA 的计算公式为：MDA （umol/L）=6.45OD532-0.56OD450.

反应体系为：400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul样品，80℃水浴10min 后，测OD532和OD450。对照用Tris-HCl.

0.6%TBA配方：称取硫代巴比妥0.6g ，溶于少量1M NaOH中，待其完全溶解后用10%TCA（称取10gTCA 三氯乙酸，溶于100ml 蒸馏水中，待其溶解即可）定容至100ml 。

H2O2测定（二甲酚橙法）：样品反应体系（82ul 溶液A+820ul溶液B （A:B=1:10）+150ul样品提取液），30℃水浴30min ，测OD560。标准曲线为:Y=0.01734X-0.0555(Y代表OD560，X 代表H2O2含量)

溶液A （200ml ）：FeSO4.7H2O 0.1835g；(NH4)2SO4 0.0872g；H2SO4(浓硫酸18M)4.58ml ，加水定容。

溶液B （200ml ）：二甲酚橙0.0234g ；山梨醇6g ，加水定容到200ml

3. 可溶性蛋白、SOD 、POD 和CAT 活性测定

样品处理：取0.5g 样品，速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml 的Tris-HCl （pH7.0）（内含有20%甘油、1mmol/L ASA（抗坏血酸）、1mmol/L DTT（二硫苏糖醇）、1mmol/L EDTA、1mmol/L GSH（还原型谷胱甘肽）、5mmol/L MgCl2）抽提，将抽提液转移到2ml 的EP 管中，于4℃，12000rpm 离心15min ，取上清，保存在-20℃下，上清液可用于可溶性蛋白、SOD 、POD 和CAT 含量测定。

1mmol/L的ASA 配制：先配制10mmol/L的母液—称取176.13mg 的ASA ，溶于100ml 的Tris-HCl （pH7.0）中即可，然后稀释10倍即可。

1mmol/L的DTT 配制：先配制10mmol/L的母液—称取154.25mg 的DDT 溶于100 ml的Tris-HCl （pH7.0）中即可，然后稀释10倍即可。

1mmol/L的EDTA 配制：用30mmol/L的EDTA 稀释30倍即可。

5mmol/L的MgCl2配制：称取MgCl2.6H2O 的101.5mg 溶于100ml 的Tris-HCl （pH7.0），即可。

样品提取液的配制（200ml ）：取10mmol/L的ASA 母液20ml ，10mmol/L的母液DTT20ml ，取30mmol/L的EDTA 母液7ml ，称取203mg 的MgCl2.6H2O ，最后再量取20ml 的甘油，将最终体积定容到200ml ，即可。

可溶性蛋白测定（Bradford 法）：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品），空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford）。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X 代表OD595) ，计算得出蛋白含量。

SOD 测定：SOD 活性的测定是根据照光时，体系中产生氧自由基使硝基四唑蓝还原成蓝色甲 (在560nm 处有一吸收峰), 而超氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。•一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半(50％) 时所需的酶量。

14.5mmol/L的dl-甲硫氨酸（分子量149.21）（现用现配）：称取甲硫氨酸216.4mg ，加少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用Tris-HCl(pH7.0)定容到100ml ，即可。

30mmol/L的EDTA （292.25）（现用现配）：称取EDTA 药品876.75mg ，加少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用Tris-HCl(pH7.0)定容到100ml ，即可。

2.25mmol/L的NBT （硝基四唑蓝）（817.6）（现用现配）：称取NBT 药品183.96mg ，加少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用Tris-HCl(pH7.0)定容到100ml ，即可。

60umol/L的核黄素(376.36)（现用现配）：先称取225.81mg 的核黄素，加少量50mM Tris-HCl(pH7.4)溶解后，用50mM Tris-HCl(pH7.4)定容到10ml ，配制成60mmol/L的母液，然后取100ul 到100ml 的Tris-HCl(pH7.4)中，即可配制成60umol/L的核黄素。

测酶活的反应介质：测定前在54ml 的14.5mmol/L的dl-甲硫氨酸中分别加入EDTA 、NBT 和核黄素各2ml ，此为反应混合液。

酶活测定：在盛有1.0ml 反应液的试管中，加入适量的酶液（50ul ）（以抑制达50%作用酶浓度为最佳）。混匀后放在透明的试管架上，于光照培养箱中准确照光10min 后，迅速测定560nm 处的光密度。以不加酶液照光液的为对照，计算反应被抑制的百分比。按下式计算超氧化物歧化酶的活性

△A ×N

酶活力 ＝───────────────

AO×W ×T ×V ×50％

式中：酶活力单位为每min 每ｇ鲜重酶活单位数；

AO为对照试管溶液在560nm 处的吸光度值;

△A 为对照试管溶液在560nm 处的吸光值与加入酶液的反应液在560nm 处的吸光值的差; N为酶液总体积；W 为提取酶液的样品鲜重g ；T 为照光时间(10min)；V 为加入酶液的体积(ml)；

POD 测定（愈创木酚法）：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。

反应混合液配制：在50ml 的50mmol/L的Tris-HCl(pH7.0)缓冲液中加入28ul 的愈创木酚，与磁力搅拌器上加热搅拌直至愈创木酚溶解，再加入19ul 的30%的H2O2，混合均匀，4℃保存。

酶活测定：取反应混合液1.0ml ，加入0.1ml 酶提取液，2min 前后，于470nm 处测OD 值，每隔1min 读数一次，以每分钟OD 值的变化表示酶活大小。（测量时再加入酶液）

CAT 测定（H2O2法）

反应缓冲液：20mM 的H2O2，使用前在25℃水浴中加热30min 。

酶活测定：取反应液1.4ml ，加入100ul 酶液，每加完一管立即计时，并迅速在波长240nm 下测定 30S 、1min30S 、2min30S 时的吸光度，以Tris-HCl 的作为空白。以1min 内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位。代入酶活力公式，以△OD*V/0.1*v*t FW 表示 CAT 活性，所有测定均重复三次。 △OD 代表空白的吸光度-样品管的吸光度；V 代表酶提取液的总体积，v 代表测量是加入的样品体积；t 代表反应时间min ，FW 代表样品鲜重。

0.1mol/LH2O2 配方：称取1.1333g 的30%的H2O2，加入100ml 的50mmol/L的Tris-HCl(pH7.4)，即可。也可以用0.01%的H2O2。

4. 叶绿素含量测定

样品处理及测定：取0.1g 样品，速于液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml 的95%乙醇抽提，将抽提液转移到2ml 的EP 管中，于4℃，12000rpm 离心15min ，取上清，上清用于叶绿素含量测定。测OD665和OD649。空白对照为95%乙醇。

Ca=13.95OD665-6.88OD649

Cb=24.96OD649-7.32OD665

总叶绿素=Ca+Cb