罗氏沼虾18SrRNA基因生物素标记探针的制备及应用
水 产 学 报第29卷第1期Vol. 29, No. 1
2005年2月 Feb. , 2005 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
文章编号:1000-0615(2005) 01-0124-04・研究简报・
罗氏沼虾18S r RNA 基因生物素标记探针的制备及应用
高风英1,2, 叶 星1, 白俊杰1, 吴锐全1, 劳海华1, 简 11
(1. , 广东广州 ;
2. 湛江海洋大学水产学院, )
关键词:罗氏沼虾;18S ; and application of the biotin 2labeled probe of
18S r RNA gene in Macrobrachium rosenbergii
GAO Feng 2ying
1,2
, YE Xing , BAI J un 2jie , WU Rui 2quan
1
1
1
111
LAO Hai 2hua , J IAN Qing , LUO Jian 2ren
(1. Pearl River Fisheries Institute , Chinese Academy o f Fishery Sciences , Guangzhou 510380, China ;
2. Fisheries College o f Zhanjiang Ocean Univer sity , Zhanjiang 524025, China )
Abstract :Probesare essential for study of gene expression and regulation. In this study , a method was established to prepare the
biotin 2labeled probe for 18S rRNA gene of freshwater prawn , Macrobrachium rosenbergii . And the labeled method was used to produce a lysozyme gene probe , then applied in analysis of lysozyme gene expression. Primers were designed according to the nucleotide sequences of 18S rRNA of Decapoda in order to isolate the 18S rRNA gene sequences of M. rosenbergii . Total genomic DNA was isolated from hepatopancreas of the freshwater prawn. A specific DNA fragment with desired size was amplified by PCR using the total DNA as templates. The DNA fragment was inserted into pGEM 2T Easy vector and sequenced. The result of BLAST and alignment analysis confirmed that the DNA fragment isolated was the 18S rRNA gene of M. rosenbergii , which was 418nt in length. Biotin 2labeled probe of the 18S rRNA was then produced by PCR using the recombinant plasmid as templates. The biotin 2212dTTP and the non 2labeled dNTP were added to the PCR reaction system. Ratio of the biotin 2212dTTP and the non 2labeled dTTP was 3to 1.
μThe yield of the labeled probe is 300ng ・L -1. The detection limit of the probe is 60pg. A biotin 2labeled probe of lysozyme gene
μwas prepared by the same label method , and the yield of the lysozyme gene probe is 500ng ・L -1. These biotin 2labeled probes were
applied in Northern dot blotting analysis of tissue distribution of lysoyzme mRNA of M. rosenbergii . Signals were scanned and quantified by Analysis System of Biology Image. The signal intensity ratio of the lysozyme to 18S rRNA represents the relative expression level of lysozyme mRNA. The results showed that the lysozyme mRNA existed in all the tissues checked , including eye , muscle , gill , hepatopancreas , haemocytes and intestine. But lysoyzme mRNA levels varied among different tissues. The highest level was found in the intestine , and the second was in the hepatopancreas and the lowest was in the muscle. The signal intensities of 18S rRNA among tissues were consistent , which showed that the 18S rRNA gene expressed stably in different tissues and could be used as an internal standard for researches of specific gene expression in prawns.
K ey w ords :Macrobrachium rosenbergii ; 18S rRNA ; clone ; biotin 2labeled probe ;internal standard
探针(probe ) 是带有标记的特定DNA (RNA ) 片段, 是核酸杂交鉴定特定基因以及研究特定基因组织表达的重要工具[1]。PCR 标记法是近年来发展起来的酶促标记基
因探针的方法之一[2]。常用的标记物有放射性物质(如γ232P ) 和非放射性物质(地高辛, 生物素, 荧光素等) [2]。在非放射性的标记物质中,
生物素由于具有较高的化学稳定
收稿日期:2003211217
资助项目:广东省自然科学基金项目(20010673)
作者简介:高风英(1976-) , 女, 山东潍坊人, 硕士研究生, 主要从事水产生物技术研究。通讯作者:叶 星, Tel :020-81616127, E 2mail :[email protected]
性和使用安全等优点而受到瞩目[3]。在研究特定基因组织表达的过程中, 由于仪器精确度限制和操作误差等因素, 使用于杂交的各样品上样量难以达到绝对一致。如没有内参照杂交信号间的可比性就会降低而影响实验结果的可靠性。脊椎动物的基因表达检测多使用β2肌动蛋白作为内参照[4, 5]。无脊椎动物的研究则用β2肌动蛋白也有用18S rRNA 的。18S rRNA 基因是真核生物编码核糖体
RNA 的基因之一, 与5. 8S 和28S 组成一转录单元, 存在于
dCTP (10mmol ・L
-1
-1
) 1μL , dGTP (10mmol ・L ) 1μL ,
dTTP (10mmol ・L -1) 0. 75μL -1) L , Biotin 2dTTP (0. 5mmol ・5μL , P11μL , P21μL , Taq 酶0. 5μL , 模板2μL , 总体积50μL 。反应条件:94℃预变性3min 后进入循环:94℃3min 预扩增, 然后进入循环,94℃30s ,56℃45s ,72℃1. 5min ,30个循环,72℃延伸8min 。
1. 4 探针标记产量及检测灵敏度测定
所合成探针经纯化后, 紫外分光光度计测定所标记探针的产量。参考文献[13]将合成的DNA 探针依不同的浓度倍比稀释, 95℃热变性10min 后, 、封闭、酶联、。X 机体的所有细胞内
[6]
。早期无脊椎动物的相关研究中大
[7, 8]
多未使用标记探针, 而直接通过电泳和溴化乙锭染色, 把
18S rRNA 条带作为上样量和RNA 质量的参照
32
。近年用地高
来开始使用标记探针, Destoumiex 等使用P 标记探针检测南美白对虾抗菌肽的组织表达蛋白基因的表达。Chan [12[9, 10]
。Y eh 等
[11]
. T 2
为模板。用于扩增罗氏沼虾溶菌酶基因片段的特异引
辛标记的β218S 18S rRNA 。本实验采用PCR 法制
物为:P15’2GTG ATA ATA CTT GGA TCA TAG AAA TG 2
3’, P25’2CTA GAA CGG GAA GAC AGA GTT GG3’。扩
备罗氏沼虾18S 基因生物素标记探针, 并应用此标记方法制备溶菌酶基因生物素标记探针, 用于检测罗氏沼虾溶菌酶基因的表达, 为虾类和其它无脊椎动物特定基因表达研究过程内参照探针和生物素标记探针的制备提供技术参考。
增与标记方法同上。探针使用前95℃变性10min , 立即置于冰上待用。
1. 6 斑点杂交检测罗氏沼虾溶菌酶基因的组织
表达
预杂交和杂交:将用Trizol 试剂提取的眼、肌肉、鳃、肝胰腺、血淋巴和肠管等组织的总RNA 约5μg , 变性后点于干燥的尼龙膜上, 微波炉750W 烘烤2~3min 。于42℃预杂交2h 后, 置于含探针(100ng ・mL -1) 的杂交液(含
50%甲酰胺) 中过夜(16~18h ) 。
1 材料与方法
1. 1 试验虾、酶和主要试剂
罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii ) 购自广东肇庆市养殖户。限制性内切酶、T4DNA 连接酶等主要试剂购自华美生物工程公司或Promega 公司。总DNA 提取盒和
pGEM -T Easy Vector 为Promega 公司产品。大肠杆菌DH5α由本室保存。扩增引物由上海生物工程公司合成。
洗膜及杂交结果检测:杂交后的尼龙膜用含0. 5%
SDS 的2×SSPE 室温漂洗2次, 每次15min 。含0. 5%SDS
的0. 2×SSPE 55℃洗2次, 每次30min 。然后按以下步骤检测:detectorblock solution 温育45min 后换新溶液并加入
AP 2SA 温育30min 。用1×phosphatase wash solution 中洗3
生物素标记的单核苷酸(biotin 2212dTTP ) 购自Clontech 公司。
次, 每次5min 。再在1×assay buffer 中洗2次, 每次2min 。于CDP 2star chemiluminescent substrate 中静置温育5min 。蘸去多余水分后, 将尼龙膜放在杂交袋中, 在暗盒中曝光于X 胶片。常规手工洗片保留结果。将杂交后的尼龙膜用煮沸的0. 1%SDS将第1次杂交的探针洗脱下来以后再与第2个探针杂交。杂交条件及程序同上。
光密度扫描与数值统计:曝光信号用FR 21000生物图像分析系统分析杂交斑点的平均光密度。该光密度和斑点的面积的乘积代表杂交信号的强度。杂交信号强度的数值分析方法参照文献[9, 10], 重复3次实验, 取其结果平均值。
1. 2 罗氏沼虾18S r RNA 基因片段的克隆
按DNA 提取试剂盒介绍的方法提取罗氏沼虾肝胰腺总DNA ,1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA 的质量和浓度。参照已报道的十足目种类18S rRNA 基因序列, 设计并合成PCR 引物P1:5’AGG GAA GAG CGC TTT TAT TA3’,
P2:5’CTA TTG GAG CTG GAA TTA CC3’。以提取的总DNA 为模板, PCR 扩增罗氏沼虾18S rRNA 基因片段。目
的基因的克隆方法参照文献[2]。重组质粒在
ABIPRISM
TM
377全自动荧光测序仪上进行序列测定。用
DNA 分析软件VECTOR NTI 6. 0和Internet 上的Blast 程序
进行序列分析比较。
1. 3 18S r RNA 基因片段的生物素标记
以18S rRNA 基因片段的重组质粒为模板, 进行PCR 扩增标记。反应体系:H 2O 28μL , 10×PCR Buffer 5μL ,
MgCL 2(25mmol ・L
-1
-1
) 4μL , dATP (10mmol ・L ) 1μL ,
2 结果
2. 1 罗氏沼虾18S r RNA 基因片段的克隆与测序
胶回收大小约400bp 的特异带并克隆到T 载体上, 筛选并酶切鉴定重组子(图1) 。重组子序列测定表明所克
隆的基因片段确为罗氏沼虾的18S rRNA 基因片段
(GenBank accession no. A Y 461599) 。该基因片段与同属长
2. 2 18S r RNA 基因探针标记产量与灵敏度
紫外分光光度计测定所标记探针的产量约为300ng ・μL -1。探针样品直接点膜酶联显色检测18S rRNA 基因探针的灵敏度约为60pg (图2)
。
臂虾科的小长臂虾(Palaemonetes kadiakensis ) (M34359) 相应片段同源性高达90%; 与不同科的其它种类如玻璃虾科的猛细螯虾(Parastacus pugnax ) (AF235969) 、龙虾科的海岛岩龙虾(Jasus tristani ) (AF498664) 等的同源性均高于85%
。
图218S gene probe
-:ng ;3. 78ng ;1. 92ng ;0. 94ng -5:0. 48ng ;0. 24ng ;0. 12ng ;60pg ;30pg
2. 3 18S r RNA 生物素标记探针在罗氏沼虾溶菌
酶基因表达研究中的应用
用所制备的生物素标记内参照18S rRNA 基因探针和溶菌酶基因探针与各组织总RNA 样品进行斑点杂交, 显示罗氏沼虾溶菌酶基因在眼、肌肉、鳃、肝胰腺、血淋巴、肠
图1 罗氏沼虾18S rRNA 基因重组子酶切鉴定
Fig. 1 Identification of 18S rRNA recombinants
1. λDNA /Hin d ⅢDNA marker ; 2. T vector /pst Ⅰ; 3. T 218S recombinant/Eco R Ⅰ; 4. 200bp marker
管等组织中均有表达(图3) , 但表达量有差别。其中在肠管中的相对表达量最高, 肝胰腺次之, 肌肉中的相对表达量最低(图4) 。18S rRNA 基因在各组织间获得了相近的杂交信号强度
。
图3 罗氏沼虾溶菌酶基因在各组织中的表达
Fig. 3 Tissue expression of M. rosenbergii lysozyme gene
左图:溶菌酶基因探针与各组织总RNA 斑点杂交; 右图:18SrRNA 探针与各组织总RNA 斑点杂交
left :Northern dot blotting with lysozyme probe ; right :Northern dot blotting with 18S rRNA probe
lane A 1-3:眼; 肌肉; 鳃; lane B 1-3:肝胰腺; 血淋巴; 肠管
lane A 1-3:eye ; muscle ; gill ; lane B 1-3:hepatopancreas ; haemocytes ;intestine
3 讨论
本实验用PCR 法成功合成了生物素标记的DNA 探针, 且所制备的探针检测灵敏度较高。高志贤等用生物素标记的葡萄球菌肠毒素B 基因探针的检测灵敏度为250
pg
[14]
素的臂长不同所致。本实验使用的生物素标记的单核苷酸为biotin 2212dTTP , 而前者使用的为biotin 2112dTTP 。生物素的臂长越长, 在标记过程中的掺入率会降低但臂长越长其检测灵敏度会越高[15]。本实验使用biotin 2212dUTP 是目前使用的连接臂最长的生物素, 可有较高的检测灵敏度。
杂交过程中DNA 分子量的大小和浓度直接影响杂交
, 本实验所合成的探针检测灵敏度为60pg , 比前者
高出4倍。灵敏度差异的原因可能是由于所使用的生物
1期 高风英等:罗氏沼虾18S rRNA 基因生物素标记探针的制备及应用127
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图4 罗氏沼虾溶菌酶基因在各组织中的表达
Fig. 4 Tissue expression of M. rosenbergii lysozyme gene
1. 眼; 2. 肌肉; 3. 鳃; 4. 肝胰腺; 5. 血淋巴; 6. 肠管
1. eye ; 2. muscle ; 3. gill ; 4. ;
5. 速度。, [14], 探针bp 100~150个碱基可接合1个生物素
[3]
, 本实验设计标记的
18S rRNA 的长度为418bp , 溶菌酶探针长度为477bp , 均
有较好的杂交效果。检测过程中生物素标记的核酸探针与链酶亲和素(抗生物素蛋白) 和碱性磷酸酶的复合物结合, 可使加入的碱性磷酸酶作用底物在暗处发出肉眼可见荧光, 该荧光可持续几小时到数天。本实验观察到的可见荧光持续时间大约为24h , 每次曝光时间只需1~3min 。因此可供多次曝光, 克服了放射性标记检测曝光时间长, 基本上不能重复曝光的缺点。所制备的18S rRNA 生物素标记探针初步应用于检测罗氏沼虾溶菌酶基因组织表达, 结果显示18S rRNA 探针在各组织间获得了相近的杂交信号强度(图4) , 溶菌酶基因的杂交信号则有差异(图3) , 显示出较好的内参照效果。目前本实验室正应用此标记探针进一步检测罗氏沼虾受细菌感染后溶菌酶基因表达水平的变化。此探针制备方法的建立也可为今后虾类及其它无脊椎动物的特定基因表达研究提供参考。