抗菌药物作用机制的研究方法
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抗菌药物作用机制的研究方法‘
张章,肖春玲
(中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所,北京100050)
[摘要]
抗菌药物作用机制的研究方法包括形态学观察法,同位素前体参入技术,血清药理学方法,对
药物、靶点及两者相互作用的结构研究,基因芯片技术,蛋白质组学等方法。药物、靶点及两者相互作用的结构研究方法主要介绍了相关的2种新技术:x晶体衍射技术和分子动力学模拟技术。通过鉴定临床耐药菌株基因突变位点,寻找全新的作用靶点的方法是抗菌药物作用机制研究的新思路。
[关键词]
抗菌药物;作用机制;研究方法
[文献标识码]A
【文章编号]1003—3734(2008)07一0540—04
[中图分类号】R965.2
Methods
forresearchingmechanismsofantimicrobialagents
ZHANGZhang,XIAOChun—ling
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Bio抛c^no肠g,,,c^inese
[Abstract]
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.[Keywords]antimicmbialagents;mechanism;researchmethod
抗菌药物耐药性的问题已在全球范围内给人类健康带来了巨大压力…,研究具有全新作用机制的新型抗菌药物已成为非常紧迫的任务。很多现有抗菌药物的作用机制和靶点还不甚明确;而用特定模型筛选出的有抗菌活性的物质,其作用机制也需要进一步验证。因此深入研究抗菌药物的作用机制是十分必要的。
在无数前人工作的基础上,多种抗菌药物的作用机制已经得到一定程度的阐明,并且仍然在被科学家不断完善。近年已经完成的对结核分枝杆菌等重要致病菌的基因组的研究,又揭示了许多潜在的新抗菌药物作用靶点。抗菌药物作用机制已经从最初的初步形态学观察转向更深入的分子生物学水平。而寻找新的抗菌药物及作用靶点,以克服耐药性,已成为研究热点。但是,由于所采用的研究方法均具有其自身局限性,对抗菌药物作用机制的研究仍然会任重道远。现对抗菌药物作用机制的几种研究方法进行简要综述,以期为发现和研制更理想的抗菌药提供有益的线索和理论依据。
・基金项目:北京市科技计划专项(D0204003000031)
l形态学观察法
形态学观察法是利用光学显微镜、电子显微镜、扫描探针显微镜、扫描隧道显微镜等,结合染色技术直接观察药物作用于微生物或细胞后,其线粒体、内质网、核膜、核内染色质的变化,从细胞器水平初步了解药物的作用机制,再结合已有文献进行理性分析,进一步推测分子作用机制的方法。其优点是简单、快速、直观、易操作,通常用于初步鉴定药物作用机制。细胞形态的变化提示药物可能的靶点或作用方式。Frost等口。通过观察cnndi如.口f6幻伽s细胞的形态变化,筛选真菌细胞壁合成和装配的抑制剂,他们将抗真菌药物及天然产物作用后c口ndid口.oZ一6ic口ns的形态变化分为7类,包括正常的圆形细胞、体积增大的球形细胞、椭圆形细胞、成串的球状细胞、丝状生长的细胞、形成多细胞聚合体的圆形小细胞、玫瑰花环形细胞等,并根据形态学变化推测抗真菌药物的可能作用靶点。如葡聚糖合成抑制剂p叩一
ulacandin
B和脂肽通常导致细胞体积增大;而尼柯
霉素作用的Condid口.口胁i∞舢细胞在产生隔膜和细
一540一
万方数据
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胞分裂方面出现障碍,形成串珠状细胞,提示药物可能干扰几丁质的合成。王理达等"。在研究澳洲茄胺、紫檀、白鲜碱对Profo历ec口埘ic.|}e砘口m五和5口cc矗口一
rom弦嚣ce硎如i口eGLl7两种真菌细胞遗传物质的影
响时,利用激光扫描共聚焦显微镜(LscM),获取了吖啶橙(A0)染色后的单细胞或细胞群的DNA和RNA等细胞特异结构的清晰荧光图像;并将DNA和RNA分别进行定性、定位后,结合图像分析仪,对其图像平均荧光强度、积分荧光强度及细胞的面积、圆心因子等参数进行自动测定。观察到经3种活性物质处理的Pr0£o啦eco钾如后e地口m越的细胞体积均显著增大,荧光强度增大,提示这些药物直接或间接干扰DNA合成;而用紫檀芪、白鲜碱处理S口cc五。romy—
c部ce聊;5ioeGLl7时,细胞体积显著增大近球形,提
示二者可能干扰细胞壁的合成。
2
同位素前体参入技术
同位素前体参入技术是利用放射性核素作为示
踪剂,对研究对象进行标记的微量分析方法。基本原理为用同位素作为一种标记,制成含有同位素的标记化合物,代替相应的非标记化合物,利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质,用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等。此方法具有灵敏度高、简便易行、定位定量准确等优点,已被广泛应用于抗真菌抗生素等各类药物的作用机制研究。熊英等"。在研究黄芩苷对白念珠菌的作用机制时,采用同位素参入技术,用[3H]一TdR,[3H]一udR和[3H]一亮氨酸作为参入前体来了解黄芩苷对白念珠菌的DNA、RNA及多肽合成的影响。通过液体闪烁计数法得到对照组与黄芩处理后的实验组的每分钟脉冲数(cpm),计算黄芩
对3种参人前体的参入抑制率。实验结果表明黄芩
苷明显抑制3种标记前体对白念珠菌菌体的参入,推测黄芩苷抗自念珠菌的作用机制是通过抑制白念珠菌的DNA、RNA和蛋白质的生物合成,导致菌细胞死亡而起到杀菌作用。用同样的方法,谢小梅等¨o研究了肉桂醛和柠檬醛对曲霉菌的抗菌作用机制,发现用药后[3H]-TdR,[3H]一UdR和[3H]-亮氨酸3种标记前体参入较对照组显著减少,并结合扫描电镜观察用药前后曲霉菌形态学变化,推测肉桂醛和柠檬醛通过影响曲霉菌的DNA、RNA以及蛋白质的合成而表现抗菌效应。
3
血清药理学【serumpharmacology)
血清药理学主要是通过研究给药动物血清的生
物学活性来揭示药物作用机制。在抗菌药物作用机制的研究中,此方法主要通过对家兔或大鼠等动物
万方数据
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进行灌胃给药后一定时间内采血,分离血清,用含此药物成分的血清来进行最低抑菌浓度(MIc)测定或抑菌活性实验等一系列体外药理实验,观察含药血清对正常或病理状态下的离体器官、细胞或体外培养细胞的作用,进而揭示抗菌药物作用机制。这种方法最大的优势在于,它可以反映药物在体内产生作用的真正有效成分,并且克服了药物成分及作用机制复杂的中药及中药复方制剂直接进行体外实验研究药物作用机制的困难,被研究人员广泛关
注Mo。陈林娜等¨1采用血清药理学检测方法,研究
了中药制剂“肺炎1号”、“热必宁”、“清胆糖浆”对耐青霉素肺炎链球菌(PRP)的抑菌作用。实验采用不同滴度的含药血清进行抑菌试验,经过统计学分析了解抑菌效果。发现3种中药制剂对PRP菌株均有明显抑制作用,同时结合透射电镜观察到细胞膨大、细胞壁破裂、内容物溢出等细菌结构变化,推测其抑菌作用是破坏了细菌胞壁结构,使包膜屏障的通透性改变,药物渗透,抑制了细菌的生长繁殖。
血清药理学方法为研究抗菌药物作用机制提供了一种思路,尽管这种方法在我国起步较晚,并且有其自身局限性,如在凝血实验中不适宜使用,但是它可以较为客观地揭示抗菌药物在胃肠代谢过程中活性成分的转化和改变,更加真实地反映药物的作用机制。所以,血清药理学方法已经越来越多地运用到抗菌药物作用机制的研究中。
4对药物、靶点及两者相互作用的结构研究
对于药物功能及作用机制的研究,归根到底是对于其不同阶段结构变化的研究,结构决定功能,所以,要想深入探求药物的作用机制,就要在分子水平上对药物、靶点及二者相互作用的结构进行阐释。结构测定技术主要包括核二维和多维磁共振技术(NMR)、x晶体衍射技术、圆二色谱以及计算机和资料分析技术等,而目前这些技术已经相对较为成熟。Baldock等¨1为了获得二氮硼烷类抗生素对参与脂肪酸合成的烯酰基还原酶(ENR)抑制作用的分子解释,运用x晶体衍射技术分析了Esc危e而c矗施co既的ENR,NAD+和抗生素噻吩并二氮硼烷或苯并二氮硼烷的复合体结构,收集了一系列衍射数据,计算了电子密度,并根据同晶置换法获得E.co如ENR—NAD+复合物母核的分子置换溶液,从而计算相角,并绘制了电子密度图和傅立叶图。分析图谱得出,2种二氮硼烷类化合物都毗邻于酶辅助因子NAD+的烟碱环,并落于ENR形成的口袋结构中,而且二氮硼烷的硼原子与NAD+烟碱核糖的2’羟基氧原子还形成B—O共价键。最终得出结论,二氮硼烷类抗
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曼!!!望!』!!翌型垡塑!兰旦翌墨苎!!!!:!!!:!!塑!:!生素对ENR有强烈的抑制作用,并且二者的结合需要NAD+的参与。x晶体衍射技术具有精确直观,不需破坏生物大分子,速度快,不受测量分子大小限制等优点,但是摸索蛋白结晶条件往往是这项技术的限制与瓶颈。
随着生命科学与计算科学的相互交叉,分子动力学(MD)模拟的方法也用于药物结构及作用机制的研究,并发挥了很大作用。所谓MD模拟,是指对原子核和电子所构成的多体系统,用计算机模拟原子核的运动过程,从而计算系统的结构和性质。模拟技术以其高效、精确,程序简单,计算量小,同时可以重现一些目前的技术手段所不能检测到的药物与靶点的真实反应过程,成为备受瞩目的研究药物作用机制的方法旧1。马国政等¨驯应用Discove珂Stu.
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Modeling程序对喹诺酮类抗生素诺氟沙星.DNA
复合物进行分子建模,构建了其初始结构,通过2ns的非限制性MD模拟研究表明,诺氟沙星能够和双螺旋d[ATATCGATAT]:形成稳定的复合物,药物分子可以紧密地结合在DNA的小沟区域,并且能够与DNA的G碱基的氨基氢原子形成2个稳定的氢键。在分子水平上提供了诺氟沙星直接与双螺旋DNA相互作用的结构及复合物的动态变化情况,从而进一步证明了喹诺酮类抗生素的抗菌作用机制与直接抑制DNA有关。
结构分析不仅可以获得药物作用机制在分子水平的解释,还有助于基于靶点的结构进行理性的设计药物。结构分析和具体实验技术的结合,必将大大促进药物作用机制的深入研究。5基因芯片技术
基因芯片技术是在20世纪末发展起来的一项新的规模化生物信息分析技术,其基本原理是将许多特定的DNA片段、cDNA片段、寡核苷酸片段作为探针,有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上,然后与待测的荧光标记样品进行杂交,杂交后用激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描,通过计算机系统对每一探针位点的荧光信号做出检测、比较和分析,从而迅速得出定性和定量的结果。目前该技术已被应用于生命科学的众多领域,主要包括基因表达检测、基因突变检测、基因诊断、功能基因组研究、基因组作图、杂交测序和新基因的发现等多个方面。与此同时,生物芯片很快发展成为研究药物作用机制的新方法。1999年,wilson等…3应用含有97%的从结核分枝杆菌(MTB)全序列预测出的开放阅读框架的DNA芯片,来监测抗结核药物异烟肼(INH)作用于MTB后其基因表达的变化,观
一542一
万方数据
史垦堑麴苤查!塑!至笙!!鲞笙!塑
察到INH可以诱导许多编码与此种药物作用机制相关蛋白的基因的表达发生变化,其中包括一个含有5个基因的编码II型脂肪酸合成酶的操纵子序列和编码海藻糖二分枝酰基转移酶的基因mpc。一些间接受影响的生物合成途径中所涉及的基因,也在一定程度上被诱导,其中efpA,fadE23,fadE24和ahpc有可能调节与INH毒性有关的过程。这种方法有助于详细描述新发现的药物作用靶点,同时也为鉴定新化合物是否抑制这些靶点提供了新思路。2006年,Fu¨21将寡核苷酸芯片应用于MTB药物基因组学的研究。将药物作用于MTB,用寡核苷酸芯片检测INH和乙硫异烟胺2种药物诱导的基因表达,并与其他相关的研究方法做对比,建立了跨平台分析方法。他们用这种方法不仅识别了所有先前相关工作中所报道过的药物诱导基因,还发现了一些其他先前用同种药物作用后并没有发现的药物诱导基因。应用寡核苷酸芯片发现,特定浓度的INH和乙硫异烟胺均可诱导Rv2524(fas)的表达,而这一发现与先前观察到的INH不能诱导fas表达恰恰相反。寡核苷酸基因芯片已经成为一种研究药物基因组学的可信赖的工具,并越来越多地用于药物研发中。6蛋白质组学
。
蛋白质组学是以细胞或机体全部蛋白质的表达及其活动方式为研究对象,采用高分辨率的蛋白质分离手段,结合高通量的蛋白质鉴定技术,研究在各种特定情况下的蛋白质表达谱。主要涉及双向凝胶电泳、二维色谱、二维毛细管电泳、液相色谱毛细管电泳以及质谱等技术。
近年来,蛋白质组学与药学研究的关系越来越密切。应用蛋白质组学技术,高通量地对比分析药物或天然活性产物作用前后蛋白质表达谱或蛋白质表达丰度的改变,可以发现和确认药物作用的靶点,更加详尽地阐明药物天然活性产物的作用机制。目前,蛋白质组学已经逐渐应用于抗菌药物作用机制的研究,并且取得了一定的进展。Bmneau等¨列应用蛋白质组学对白念珠菌在给吡啶类药物氟康唑和伊曲康唑以及mulundcadin类药物后的蛋白谱表达的变化,发现吡啶类药物的作用机制为抑制麦角固醇合成酶的表达,而mulundcadin类药物的作用机制为抑制l,3一D.葡聚糖合成酶的表达。药物作用靶点的阐明,药物作用机制的明确将有助于理性高效地开展药物研发工作。Hughes等¨4。应用毛细管电泳和质谱技术对INH作用后的结核杆菌的蛋白表达进行了定性和定量分析,发现kas操纵子(AcpM,KasA,KasB,Accd6)编码的蛋白有明显的
垦!!!!!!!!!巴!!垡塑!!旦型g!!塑!:!型:!!塑!:!
过量表达,而这些蛋白与铁离子代谢和细胞分裂有关,提示药物通过影响细胞代谢引起复杂的相互作用。最终导致细胞死亡。
应用蛋白质组学研究抗菌药物作用机制,是对DNA芯片这一转录水平上的研究方法取得的信息的充分补充。
7研究抗茵药物作用机制的新思路
对于已知作用机制的抗菌药物,我们可以通过鉴定耐药菌株的突变位点,来发现已知基因突变以外的新的基因型突变位点,从而揭示未被发现的药物作用机制。对于抗结核药物lNH,一致认同的作用机制是:它是一种前药,在体内被kat—G编码的过氧化氢一过氧化物酶激活,生成的异烟酰基再通过与NAD+非酶促反应生成许多4-异烟酰基一NAD加合物|1引。其中的4S型异烟肼一NAD加合物以inh—A编码的烯酰基一酰基载体蛋白还原酶为靶点,抑制结核分枝杆菌胞壁酸的合成¨“。对INH临床耐药株的研究发现,大部分耐药株都是在编码2个关键酶的kat.G和inh_A两个基因发生了突变,但是仍有lO%~25%的耐药株没有鉴定出基因型突变位点¨”。这一分析提示,除了上述的作用机制,INH还可能通过其他作用机制发挥作用。鉴于生成了多种吡啶核苷酸类的加合物,研究人员全面考虑了结核分枝杆菌中依赖毗啶核苷酸这种结构的酶,最终推测出二氢叶酸还原酶(DHFR)为INH作用的新靶点。Ar—gymu等¨副通过体外抑菌实验、晶体方面研究,在细胞中过表达DHFR观察其通过富集药物对细胞模型的保护作用等实验,确定了4尺型异烟肼・NADP加合物为DHFR的底物抑制剂,证明了先前的设想。
通过鉴定临床耐药株的基因突变位点,有可能发现全新的药物作用和耐药机制,为抗菌药物的研制提供新的靶标。8结语
通过总结几种抗菌药物作用机制的研究方法不难看出:各种研究方法并不是孤立存在,而是联合应用,互相辅助的。如谢晓梅等¨。运用扫描电镜及同位素标记技术,研究具有良好抗曲霉菌作用的中药活性成分肉桂醛与柠檬醛的抗真菌机制;而且,作用机制的研究范畴向细胞及分子水平发展,尤其是蛋白质组学、基因组学、生物信息学等学科的发展,又为抗菌药物作用机制的研究带来新的契机¨91。
[作者简介】
张章(1983一),女,硕士研究生,主要从事抗
结核药物研究。联系电.话:(010)63165277,E.mail:zhan.
gzl31@163.com。
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中国新药杂志2008年第17卷第7期
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