FluorCam叶绿素荧光成像一

FluorCam叶绿素荧光成像技术

（2012年5月中科院植物所   叶绿素荧光技术及其应用研习班） 易科泰生态技术公司   Ecolab生态研究室

FluorCam叶绿素荧光成像技术及其应用

•  •  •  •  •  叶绿素荧光技术   FluorCam叶绿素荧光成像   FluorCam叶绿素荧光成像应用案例   Ecolab实验室叶绿素荧光成像实验   FluorPen手持式叶绿素荧光仪与AquaPen 藻类荧光仪

叶绿素荧光技术发展

•  Kautsky  effect:  Kautsky  and  Hirsch  (1931)  首次用肉眼发现 叶绿素荧光现象并发表论文“CO2同化新实验”，后被 称作“Kautsky  effect”   •  PAM  (Pulse  Amplitude  Modulated  Fluorometer):   Schreiber（1986）等发明了PAM脉冲调制技术测量叶绿 素荧光   •  FluorCam：KineKc  imaging  of  chlorophyll  fluorescence:   Ladislav  Nedbal（2000）等于上世纪90年代末期发明了 与PAM技术相结合的叶绿素荧光成像技术   •  Chlorophyll  a  Fluorescence,  A  Signature  of   Phptosynthesis（Papageorgiou  and  Govindjee,  2009）

–  Ulrich  Schreiber,  Pulse-­‐Amplitude-­‐ModulaKon(PAM)   Fluorometry  and  SaturaKon  Pulse  Method,  An  Overview   –  Ladislav  Nedbal,  Chlorophyll  Fluorescence  Imaging  of  Leaves   and  Fruits

叶绿素荧光技术常用参数

•  Fo、Fm与QY，此外还有PAR_Abs及ETR   •  Kautsky诱导效应：Fo，Fp，Fv，Ft_Lss，QY， Rfd   •  荧光淬灭分析：Fo，Fm，Fp，Fs，Fv，QY， ΦII，NPQ，Qp，Rfd，qL等50多个参数   •  OJIP与JIP-­‐test：Fo，Fj，Fi，P或Fm，Mo（OJIP 曲线初始斜率）、OJIP固定面积、Sm（对关闭 所有光反应中心所需能量的量度）、QY、PI等   •  光响应曲线LC：Fo，Fm，QY，QY_Ln

Kautsky  effect

（资料源自Ecolab实验室荧光成像数据库）

荧光淬灭分析（Quenching  Analysis）

1.  Fv/Fm,  最大光量子产量   2.  Fq’/Fm’，Genty参数、ϕPSII，又称光量子效率，用于光化学过程分析评估， 表示PSII吸收的光辐射用于光化学过程的比率，不需要暗适应，但受自然 光照影响大   3.   Fv’/Fm’，开放PSII反应中心的光量子效率，不需暗适应   4.  Fq’/Fv’，光化学淬灭qP，大致相当于初级受体QA的再氧化状态   5.  (Fm-­‐Fm’)/Fm’，非光化荧光淬灭

FluorCam

荧 光 成 像 ： 荧 光 淬 灭 分 析

JIP-­‐test（电子传递抑制剂敌草隆对OJIP的影响

叶绿素荧光技术著名厂商

•  PSI：捷克Brno（孟德尔在此实验并发现著名的孟德 尔遗传定律），Ladislav  Nedbal为首席科学家和主要 股东（另一股东为David  Kramer，美国密执根州立 大学教

授），1997年为美国华盛顿大学H.  Pakrasi教 授研制成了第一台FluorCam荧光成像系统。主要产 品有

–  FluorCam叶绿素荧光成像系列产品   –  FL3500/FL5000双调制荧光仪系列产品   –  FluorPen及AquaPen等手持式荧光仪产品   –  光养生物反应器等藻类培养与在线监测产品   –  光源与植物培养室

•  Walz：德国，主要产品为PAM2500叶绿素荧光仪等   •  OpKcs：美国，主要产品为OS5p-­‐PAM叶绿素荧光仪 等

FluorCam叶绿素荧光成像

1.  2.  3.  4.  5.  6.  7.  8.  9.  10.  11.  12.  13.  Handy  FC——便携式叶绿素荧光成像仪   Handy  GFPCam——便携式荧光成像仪   Handy  Leaf-­‐chamber——便携式光合联用叶绿素荧光成像系统   Open  FC——开放式叶绿素荧光成像系统，有13x13cm和20x20cm两种配 置方案   Closed  FC——封闭式叶绿素荧光成像系统   Closed  GFPCam——封闭式多光谱荧光成像系统   Micro-­‐FluorCam——显微叶绿素荧光成像系统，又分标准版、增强版 （可选配GFP  Filter  Cube  Set）及滤波轮版   Rover  FluorCam——移动式大型植物荧光成像系统   Transect  FluorCam——样带扫描式植物荧光成像系统   XY-­‐Plane  FluorCam——多光谱XY-­‐平台式大型植物荧光成像系统   Conveyor  and  RoboKc  PlantScan  System——PlantScan全自动植物光谱成像 分析系统   Arch  FluorCam——拱形三维植物荧光扫描成像系统   Fluorescence  KineKc  Microscope——FKM荧光动态显微光谱成像系统

FluorCam荧光成像技术特点

•  •  •  •  •  •  •  •  •  •  •  高灵敏度CCD镜头，时间分辨率可达每秒50张，快速响应和实验程序分析，精 确反映叶绿素荧光瞬变   可选配高分辨率（高像素值）CCD镜头，适于需要高分辨率荧光成像分析如 GFP等稳态荧光   软件具备Fv/Fm、Kautsky  诱导效应、荧光淬灭分析、稳态荧光成像、PAR  吸 收指数、LC等自动实验程序，实验程序可设置更改，或创建新的实验程序   具备实验程序自动重复功能，从而实现无人职守自动成像实验   “4+1”LED光源（周边4个LED光源板，顶部一个LED光源板），可选配红色光 源、橙色光源、绿色光源、青色光源、蓝色光源、白色光源、红外光源、紫 外光源等各种波长光源，光强可达10000μmol/m2.s   可选配单周转光闪（STF），100μs光闪（光脉冲）强度达120000μmol/m2.s   可选配8位滤波轮   可选配QA再氧化动力学测量模块   可选配OJIP快速荧光动力学测量模块   可选配可见光真彩成像分析模块   可选配植物呼吸与光合作用测量模块

FluorCam便携式叶绿素荧光成像仪

最大成像面积3.5x3.5cm，   备选配件包括叶夹、三脚架、便携蓄电池等

FluorCam封闭式叶绿素荧光成像系统

成像面积可达13x13cm，   可选配QA再氧化测量模块、OJIP测量模块等

GFPCam封闭式多光谱荧光成像系统

•  配有8位滤波轮，除具有封闭 式叶绿素荧光成像系统的功能 外，还可以成像测量绿色荧光 蛋白（GFP）等其它稳态生物 荧光   •  成像面积可达13x13cm   •  可选配QA再氧化动力学测量模 块，OJIP快速荧光动力学测量 模块

FluorCam开放式叶绿素荧光成像系统

标准版成像面积可达13x13cm，大型版可达20x20cm，   镜头光源可灵活调整

FluorCam移动式植物荧光成像系统

•  整套系统装在有4个轮子的 支架上，方便野外移动   •  镜头及光源高度可以在 20-­‐150cm范围内调节   •  可选配暗适应箱   •  成像面积20x20cm   •  可附加镜头用于真彩成像分 析

显微叶绿素荧光成像系统

•  可对植物组织、藻类等细胞或亚亚细 胞结构进行荧光成像测量   •  便携式标准版显微荧光成像系统， Olympus  CX31显微镜   •  便携式增强版显微荧光成像系统， Olympus  BX40  显微镜及可扩展配件 （通过扩展可测量GFP等）   •  多功能显微荧光成像系统，除具备 Olympus  BX40  显微镜及可扩展配件外， 还具备6位滤波轮（有机械调节和电 子调节两种模式供选配），因而除可 以成像测量叶绿素荧光外，还可测量 GFP、CY3、CY5等多种稳态荧光或生 物荧光

FKM荧光动态显微光谱成像系统

•  由显微荧光成像、双调制荧光测量及光谱仪组成   •  可同步荧光成像和点快速荧光动力学测量   •  可通过选择不同的激活光谱激活不同部位的天线色素；可用于分析 哪些色素蛋白复合体对光化学荧光淬灭或非光化学荧光淬灭贡献最 多   •  可用于活体检测非叶绿素荧光动态，如生物自发光或荧光颜料等， 并与同一细胞的叶绿素荧光动态相比较   •  可用于检测分析QA再氧化、连通性、天线大小等快速过程

样带扫瞄式植物荧光成像系统与   三维立体植物荧光扫瞄成像系统

•  样带荧光成像系统可以对20-­‐200cm或 100x200cm范围的样方植物荧光扫描成像，以 便于梯度胁迫研究等   •  立体荧光成像系统可以通过对整株植物叶绿 素荧光扫描成像，并通过软件形成3维立体荧 光成像

多光谱XY-­‐平台式大型植物荧光成像系统

•  测量系统在柜体内， 光源及摄像头高度和 位置可调   •  测量面积40x80cm或 40x100cm供选择   •  可用于培养箱样品多 光谱分析

Plant

Scan全自动植物光谱成像分析系统

•  高通量植物成像观测系统，具备植 物传送系统、植物称重系统、自动 浇灌系统等   •  可配备温湿度及光照自动控制系统   •  植物荧光成像与可见光真彩成像， 植物荧光成像面积30x35cm   •  可选配植物热成像模块   •  可选配植物红外成像模块   •  可选配植物VNIR高光谱成像分析模 块，光谱范围400-­‐1000nm，成像面 积30x35cm；或选配SWIR高光谱 （1000-­‐2500nm）成像

FluorCam荧光成像系统Protocols（实验程序）

Quenching（荧光淬灭分析）   Kautsky  inducKon（Kautsky诱导效应）   Light  curve（光响应曲线）   PAR  absorpKvity   实验程序自动重复功能   QA  reoxidaKon   OJIP，Fast  fluorescence  inducKon  with  1μs  resoluKon   Measured  parameters:  Fo,  FM,  Fv,  Fo’,  FM’,  Fv’,   QY(II)，more  than  50  calculated  parameters   •  GFP等静态荧光   •  NDVI   •  •  •  •  •  •  •  • 

Measuring  flashes

AcKnic  light

SaturaKng  flashes

Monsanto,  St.Louis,  MO,  Nov.5,  2003

Kautsky  effect  in  a  diuron-­‐inhibited  leaf   （敌草隆抑制电子传递实验）

OPEN RC: QA is oxidized - Φ is LOW

Fluor esce nce , re l.un it

1.4 1.2

CLOSED RC: QA is reduced - Φ is HIGH

H+ QA

Pheo Fe

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Fe

P680

YZ

PQ=QB PQ PQ

QAPheo

DCMU

P680

YZ

0 0.2 0.4 T IM E s , 0.6 0.8

PQH2 PQH2

2H2O

4H+

2H2O

4H+

Photon  Systems  Instruments,  spol.  s  r.o.,  CZ

Screen  mutants  by  NPQ  parameters   （通过荧光淬灭分析筛选变异植株）

ACTINIC LIGHT INPUT

0 sec

350 sec

CHL-FLUORESCENCE OUTPUT

Fast  inducKon  (1us  resoluKon)  and     QA-­‐reoxidaKon

High-­‐light  stress  sensiKvity   FV/FM

2

Microscopic  kineKc     fluorescence  imaging

100

Elodea cell diatom

FV  /  FM

FS

relative fluorescence

80

60

40

20

0 0 100 110 120 130 140 150

FS  –  F0

50  µm   Average

time / s

diatoms   Elodea     chloroplasts

Heterocyst  formaKon  in  cyanobacteria   Transmioance   FM  fluorescence

Micro-­‐FluorCam  imaging  fluorometer

Cell  death  inducKon  in  cyanobacterium  Calothrix  elenkinii

Transmioance

FO  fluorescence

重金属铜胁迫条件下的烟叶荧光成像

左图为对照烟叶，中图为通过叶脉浸泡硫酸铜30分钟后的荧光成像，右 图为经硫酸铜浸泡处理60分钟后的荧光成像。上图的荧光成像色彩代表 荧光衰减参数Rfd（Rfd=Fm-­‐Fs)/Fs，红色代表Rfd

值低，蓝色为高。Rfd可 以代表植物的光合效率，上图可以看出，跟未进行硫酸铜浸泡处理的对 照烟叶相比，随着浸泡处理后时间的延长，沿叶脉区域Rfd越来越低 （Ciscato  and  Valcke,  1998  ）

Chlorophyll  Fluorrescence  Imaging  Allows  Early  DetecKon  and   LocalizaKon  of  Lemon  Rind  Injury  following  Hot  Water   Treatment

HortScience  40,  2005

De  Novo  Biosynthesis  of  Faoy  Acids  Plays  CriKcal  Roles  in  the   Response  of  the  PhotosyntheKc  Machinery  to  Low  Temperature,   Plant  Cell  Physiol.  51(8):  1265–1275  (2010)  in  Arabidopsis

SpaKo-­‐temporal  changes  of  photosynthesis  in  carnivorous  plants   in  response  to  prey  capture,  retenKon  and  digesKon,  Plant   Signaling  &  Behavior  5:11,  1325-­‐1329;  november  2010   捕食蚂蚁后光合效率的时空变化——蚁酸

Blue  light  dose–responses  of  leaf  photosynthesis,  morphology,   and  chemical  composiKon  of  Cucumis  saKvus  grown  under   different  combinaKons  of  red  and  blue  light,  Journal  of   Experimental  Botany,  Vol.  61,  No.  11,  pp.  3107–3117,  2010

Aquapen手持式藻类荧光仪

–  分试管式和探头式两种   –  灵敏度高，测量极限达0.5μgCh/l   –  测量参数包括Ft、QY、OJIP、NPQ、 LC（光适应曲线）及OD（在680nm 和720nm的光密度，仅限于试管式）   –  QY为光合效率指标，非光化学荧光 淬灭NPQ反映吸收光能的热散失， LC为在不同光照条件下的QY变化曲 线，OD反映藻类密度和生物量   –  可选配GPS模块，从而做到定位定量 测量

QY、OJIP、NPQ、LC（光响应曲线）测量数据

藻类OJIP测量曲线

藻类NPQ测量曲线

藻类光响应曲线

Ft 10000 12000 14000 16000 18000 2000 微藻原液 50%微藻稀释液 4000 6000 8000 0

11 221 431 1221 3321 5421 7521 9621 11721 13821 34321 55321 76321 161621 371621 581621 791621 1001621 1211621 1421621 1631621 1841621

微囊藻OJIP测量分析

time(us)

25%微藻稀释液

JIP-­‐test：不同浓度微囊藻荧光参数比较   ——浓度与荧光强度呈正相关）

18000   16000   14000   12000   10000   8000   6000   4000   2000   0   1   2   3   Fj   Fi   Fm

FluorPen手持式叶绿素荧光仪

•  可测量参数包括Ft、QY、PAR、OJIP-­‐test、 NPQ（荧光淬灭分析）、LC（光适应曲线） 等   •  有固定叶夹式、分离叶夹式、探头式（可 用于野外监测）

Long-­‐term  study  on  vegetaAon  responses  to   manipulated  warming

using  open  top  chambers   installed  in  three  contrasAng  AntarcAc  habitats