琼脂扩散法测定乳链
※生物工程食品科学
2007, Vol. 28, No. 03175
琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的优化
张国只，陈林海*，杨天佑，陈洪卫，王利敏，段宇珩，秦广雍
(郑州大学离子束生物工程省重点实验室，河南 郑州 450052)
摘 要：对影响琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的四个主要因素：琼脂浓度、Tween20、培养温度、预培养进行了研究。结果表明，0.75%琼脂的效价检测培养基、0.5% Tween20的添加以及30℃培养条件，可提高乳链菌肽效价测定的灵敏度和精确性；4℃预培养有利于乳链菌肽在琼脂中的扩散。关键词：乳链菌肽；琼脂扩散；预培养
Optimization of Agar Diffusion Bioassay for Nisin
ZHANG Guo-zhi，CHEN Lin-hai*，YANG Tian-you，CHEN Hong-wei，WANG Li-min，
DUAN Yu-heng，QIN Guang-yong
(Ion Beam Bioengineering Provincial Key Lab, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)
Abstract： The four major factors agar, Tween20, culture temperature and pre-diffusion, affecting the agar diffusion bioassayfor nisin were studied. The results showed that when agar concentration is 0.75%, the addition of Tween20 0.5%, and the culturetemperature 30℃, the accuracy and sensitivity of agar bioassay for nisin can be improved. And the pre-diffusion at 4℃ canenhance the diffusion of nisin in agar.
Key words：nisin；agar diffusion bioassay；pre-diffusion
中图分类号：Q331 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)03-0175-04
乳链菌肽(nisin)亦称为乳酸链球菌素，是由乳酸乳球菌(lactococcus lactis)产生的一种34个氨基酸的多肽抗菌物质，目前作为天然食品防腐剂已经在欧盟(EU)、美国、中国、巴西等五十多个国家和地区广泛应用。测定nisin效价的方法主要有琼脂扩散法[1]、浊度检测法
[2]
究的基础上，本文对影响nisin在琼脂平板上扩散的主要因素，如琼脂浓度、培养温度、Tween20、4℃预培养等进行系统研究，旨在对琼脂扩散法测定nisin效价的条件进行优化。11.11.1.11.1.2
材料与方法材料指示菌
藤黄微球菌Micrococcus luteus AS1.2156。药品和实验器材
nisin标准品、Tween20 Sigma公司。
ProtoCOL SR自动菌落计数仪/抑菌圈测量仪 英国Synoptics公司。1.1.3
培养基
效价检测培养基[11]：胰蛋白胨0.8%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，Na2HPO4·12H2O 0.2%，琼脂1.5%，pH6.8，0.7×105Pa，灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨
、ATP生物荧光法[3]、酶联免疫吸附法[4]、流式细胞
术法[5]等方法。琼脂扩散法因具有简单、方便、经济的特点，是目前较为常用的检测方法。根据扩散形式的不同，琼脂扩散法可分为直线扩散法、点滴法、滤纸片法、管碟法和打孔法，打孔法和杯碟法应用最为广泛[1,6-10]。
琼脂浓度、培养温度、Tween20等因素对琼脂扩散法的nisin效价测定结果均有较大影响[6-8]。有报道认为0.5%琼脂浓度效价检测灵敏度最高，但平板呈半凝固状，不利于效价测定[8]。伊守亮等[7]发现琼脂浓度为1.0g/100ml，培养温度为30℃时测定效果最佳。Wolf等[8]认为Tween20能够促进nisin在琼脂中的扩散，从而提高了效价测定的灵敏度，但也有报道[6-7]认为Tween20对促进nisin在琼脂中的扩散作用影响不大。在现有研
收稿日期：2006-04-30 *通讯作者
基金项目：国家重点基础发展计划(973计划)项目(2004CB719604)
作者简介：张国只(1978-)，男，硕士，主要从事微生物育种方面研究。
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食品科学※生物工程
1.0%，NaCl 0.5%，pH 7.0，1.1×105Pa，灭菌20min。1.1.4
nisin标准液
准确称取10mg nisin标准品(106U/g)，溶于10ml0.02mol/L无菌HCl溶液中，配成103U/ml的nisin标准液，室温放置1h，4℃冰箱保存备用(不超过7d)，需要时用0.02mol/L无菌HCl溶液稀释成100、50、25、10、5U/ml五种效价的标准液。1.1.5
指示菌菌悬液
250ml三角瓶装牛肉膏蛋白胨液体培养基30ml，接种斜面保存的藤黄微球菌，180r/min，37℃摇瓶24h，OD600为1.5左右，浓度约为1.76×107CFU/ml。1.2方法
1.2.1
nisin效价测定方法
效价检测培养基冷却至45℃左右时，加入2%指示菌菌悬液，摇匀，准确吸取20ml该培养基加入水平放置的直径一致平底塑料培养皿内，凝固后用直径8mm的中空打孔器在每个平板上打出五个空洞，依次等体积加入100、50 、25、10、5U/ml的nisin标准溶液(标准液几乎充满孔洞)，盖上皿盖，静置0.5h，移至30℃培养箱内培养24h，用ProtoCOL SR测量仪测量抑菌圈直径。1.2.2
不同浓度琼脂检测平板的制备
制备琼脂浓度分别为0.75%、1.0%、1.25%、1.5%和1.75%效价检测培养基，效价测定方法参照1.2.1方法。1.2.3
不同浓度Tween20检测平板的制备
在制备效价检测培养基时，分别按0.0%(对照)、0.50%、0.75%、1.0%、1.25%和1.50% 的浓度在效价检测培养基内添加Tween20。1.2.4
不同温度培养检测平板的检测效果
用25、30、35、37℃ 4种不同的温度培养效价检测培养基，以检验培养温度对琼脂扩散法测定效果的影响。1.2.5
预培养方案
采用下面三种培养方案, 研究4℃预培养对琼脂扩散法测定效果的影响。
方案1：加入nisin标准液4℃预培养24h后，置于30℃培养箱培养18h；
方案2：加入nisin标准液后直接置于30℃培养箱培养24h；
方案3：不加入nisin标准液4℃预培养24h后，加入nisin标准液，置于30℃培养箱培养18h。1.2.6
标准曲线绘制及检测效果评价
用ProtoCOL SR测量仪测量抑菌圈直径后，以nisin标准液对数值为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标，绘制标准曲线。
标准曲线斜率可反映nisin标准液浓度变化对应的抑
菌圈直径的变化，即测定的精确性，斜率越大扩散性越好，反之越差；标准曲线与y轴截距可反映最低nisin效价时，各处理抑菌圈直径的大小，即测定的灵敏度[8]。2结果与分析
2.1
琼脂浓度对琼脂扩散法测定效果的影响
141)
m132m(径123直4圈115
菌抑1098
0.7
0.9
1.1
1.3
1.5
1.7
1.9
nisin标准液对数值(U/ml)
1. 0.75%；2. 1.00%；3. 1.25%；4. 1.50%；5. 1.75%。
图1 琼脂浓度的影响
Fig.1 Effects of agar concentration
不同琼脂浓度效价检测培养的标准曲线见图1。从图1可以看出，琼脂浓度对标准曲线的截距影响不大，这说明琼脂浓度对琼脂扩散法测定效价的灵敏度影响不明显。但琼脂浓度对标准曲线的斜率影响较大，且琼脂浓度与标准曲线的斜率呈负相关。琼脂浓度为0.75%，标准曲线的斜率最大，为3.24mm·ml/U，这说明琼脂浓度0.75%时，琼脂扩散法的精确度最高。
Issam Sebti等[12]在模拟nisin于琼脂糖凝胶中扩散时发现，琼脂糖浓度增加可致使凝胶孔径狭小致密，从而影响nisin在琼脂糖中的扩散。本研究中琼脂浓度与琼脂扩散法的精确度呈负相关的原因可能与此相似。2.2
培养温度对琼脂扩散法测定效果的影响
不同温度培养效价检测培养基24h后，除25℃的指示菌生长缓慢、抑菌圈边缘模糊外，30、35、37℃均
17)
161mm152(径14直13圈菌12抑11109870.7
0.91.11.31.51.71.9
nisin标准液对数值(U/ml)
1. 30℃培养；2. 35℃培养；3. 37℃培养。
图2 培养温度的影响Fig.2 Effects of temperature
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食品科学
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显示出比较清晰的抑菌圈。
从30、35、37℃培养的标准曲线(见图2)可知，30℃的标准曲线斜率最大，为5.9mm·ml/U，这说明30培养时琼脂扩散法的精确度最高。同时，30℃培养条件下所得标准曲线截距最大，即精确度最高。该结果同伊守亮等[7]结果相近。
另外，在实验过程中还观察到，35℃和37℃时nisin标准液蒸发很快，不利于nisin标准液在琼脂中充分扩散，有碍于抑菌圈最佳效果的观察和测量。因此，选定30℃为nisin效价测定的最佳培养温度。2.3
预培养对琼脂扩散法测定效果的影响
18171
)
mm16(径15直142圈133
菌12抑11109870.7
0.91.11.31.51.71.9
nisin标准液对数值(U/ml)
1. 方案1；2. 方案2；3. 方案3。
图3 4℃预培养的影响Fig.3 Effects of 4℃ pre-diffusion
三种预培养方案下的标准曲线见图3。从图3可见，虽方案1的标准曲线的截距(即测定灵敏度)略低于方案2和方案3，但其标准曲线的斜率最大(8.2mm·ml/U)，明显高于其它两个方案，这说明经4℃预培养能显著促进nisin在测定培养基中的扩散，提高琼脂测定法的精确度。
Piddock[13]在研究低温下细菌抗生素抗性的变化时发现，低温条件能降低细菌对抗生素的抗性。本研究中4℃预培养能显著提高琼脂扩散法的精确度的原因可能在于低温下指示菌的抗性减弱，从而有利于nisin在检测培养基中的扩散。Rogers等[14]在研究3℃低温预培养对琼脂扩散法的影响时也得出了相近的结论。因此， 低温预培养非常有利于提高琼脂扩散法的测定效果。2.4
Tween20对琼脂扩散法测定效果的影响
含不同浓度Tween20的效价检测培养基的标准曲线见图4。从图4可以看出，含Tween20的效价测定培养基的标准曲线的斜率均高于对照。含有0.5% Tween20的标准曲线的斜率和截距均为最大，这说明0.5% Tween20的精确度和灵敏度均为最高。此结论和Wolf等[8]的研究结果一致。
含0.5% Tween20和0.0% Tween20(对照)检测培养基nisin扩散效果见图5，从图中可看出相同nisin浓度下含0.5% Tween20检测培养基中的抑菌圈直径均大于对照，
2
203
6)
m
185
m
(
4
径
16直
圈
141
菌
抑
121080.7
0.9
1.1
1.31.51.71.9
nisin标准液对数值(U/ml)
1. 0.0%；2. 0.5%；3. 0.75%；4. 1.0%；5. 1.25%；6. 1.5%。
图
4
Tween20浓度的影响
Fig.4 Effects of Tween20 concentration
0.5% Tween20
0.0% Tween20
图5 Tween20扩散效果图例Fig.5 Diffusion effects of Tween20
这说明0.5% Tween20促进了nisin在琼脂中的扩散。3
结 论
3.1琼脂浓度为0.75%时，nisin扩散性最好，所得标准曲线具有较高的精确度。
3.2在培养温度为30℃条件下，抑菌圈清晰度较高，易于观察测量，所得标准曲线的精确度与灵敏度最高。3.3
4℃预培养可明显促进nisin在琼脂中的扩散，同比nisin浓度下抑菌圈直径较大，易于观察测量，所得标准曲线具有较高的精确度。3.4
Tween20明显可促进nisin在效价检测培养基中的
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食品科学※生物工程
双歧杆菌麦芽复合汁增菌培养基优选的研究
种 克，田洪涛*，桑亚新，李英军，马晓燕，庞晓娜
(河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001)
摘 要：选择麦芽汁为主要原料，以两歧双歧杆菌Bbm和长双歧杆菌Blm为实验菌株，研究了麦芽汁基础培养基中添加单一营养因子对Bbm菌细胞生长量的影响，进一步利用正交试验优化筛选出Bbm菌麦芽复合汁增菌培养基；利用优选的麦芽复合汁增菌培养基对Blm菌进行验证性增菌试验。结果表明：大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、玉米浆可显著促进双歧杆菌Bbm的细胞增殖(p＜0.01)，而磷酸氢二钾既能促进Bbm生长，又有缓冲培养基pH值的作用；利用L9(34)筛选出Bbm的麦芽复合汁增菌培养基的最佳配比为：在10°麦芽汁中添加0.3%大豆蛋白胨，0.6%牛肉浸膏，0.5%酵母膏，0.4%玉米浆，0.2%磷酸氢二钾，在麦芽复合汁增菌培养基中，经37℃ 培养12h，Bbm活菌数3.84×109CFU/ml，Blm活菌数达到3.90×109CFU/ml，较对照麦芽汁培养基的活菌数分别提高了8.17倍和8.14倍，较实验室常用的改良MRS培养基的成本降低1000元/吨。关键词：双歧杆菌；麦芽复合汁增菌培养基；优化筛选
Optimization of Reproducible Wort Medium for Bifidobacteria
CHONG Ke，TIAN Hong-tao*，SANG Ya-xin，LI Ying-jun，MA Xiao-yan，PANG Xiao-na
(College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)
Abstract ：Wort was chosen for the experiment. Effects of adding different nutriments in wort on the growth of Bbm
Bifidobacterium bifidus were examined. The optimum enrichment medium of Bbm was screened with orthogonality test. Blm was
validated in the optimum enrichment medium. The results showed that soya peptone, beef extract, yeast extract, and maizeplays a role to both promote thehydrolyzates in wort all promote the growth of Bbm (p＜0.01), and the addition of K2HPO4 growth and buffer the medium pH as well. The optimum enrichment media obtained by orthogonal test consist of adding soya收稿日期：2006-03-28*通讯作者
基金项目：河北省重大科技攻关项目(03220171D)
作者简介：种克(1978-)，男，硕士研究生，主要从事益生菌研究。
扩散，以含量0.5%的Tween20最佳。
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