第八章核酸结构.功能与核苷酸代谢

第八章 核酸结构、功能与核苷酸代谢

核酸（nucleic acid）根据所含戊糖差别，分为脱氧核糖核酸（DNA）

导言：本章开始介绍，遗传物质的储存、

和核糖核酸（RNA）。DNA主要存在于细胞核，线粒体内也存在有DNA；传递和表达RNA存在于细胞质和细胞核内。

的有关内容。

画图讲解

强调：T与U的区别。

由学生自己总结。

第一节 核酸的化学组成

核酸基本组成单位：核酸的基本组成单位是核苷酸；核苷酸完全水解

一、碱基

碱基是含氮杂环化合物，有两类：嘌呤与嘧定。其中嘌呤分为腺嘌呤

提问：DNA与RNA碱基的异同点。

二、戊糖

DNA中含β-D-2-脱氧核糖；RNA中含β-D-脱氧核糖。

三、核苷

戊糖的第1位碳原子分别与嘌呤碱的第9位N原子和嘧啶碱的第1位N原子通过糖苷键相连接形成核苷。戊糖若为脱氧核糖，称为脱氧核苷。

提问：几种核苷的命名。

四、核苷酸

核苷与磷酸通过磷酸酯键连接，即为核苷酸。含脱氧核糖者称为脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）。生物体内多数生成5′-核苷酸。

DNA和RNA基本单位：

组成RNA的核糖核苷酸主要有AMP、GMP、CMP及UMP 4种； 组成DNA的脱氧核苷酸主要有 dAMP、dGMP、dCMP及 dTMP 4种。 游离的核苷酸：

在体内还存在有重要生理功能的游离核苷酸。如3′、5′-环状腺苷酸（cAMP）；3′、5′-环状鸟苷酸等，cAMP、cGMP和激素的作用有非常密切关系，人们把cAMP称为激素的“第二信使”。ATP是体内能量的直接来源和利用形式。细菌DNA中含有众多的非甲基化的CpG模体，此模体对哺乳动物的免疫细胞具有刺激作用。研究人员正试图利用它进行疫苗的制备、肿瘤治疗与阻止免疫变态的反应的发生。

第二节 DNA的结构与功能

3′-5′磷酸二酯键是每

一、DNA的一级结构

定义：DNA分子中核苷酸的排列顺序及其连接方式。也可用碱基顺序来表示核酸的一级结构。以3′-5′磷酸二酯键相连接。

主链的两个末端：核酸分子的主链是由戊糖和磷酸所组成。主链的一端为3ˊ-末端（游离羟基末端），另一端为5′-末端（游离磷酸末端）。

一级结构的简化式：通常以5′为头写在左侧。

个核苷酸的5ˊ-磷酸和相邻核苷酸3′-羟基缩合脱水形成。

除B型构象以外天然DNA还有A型、Z型构象。 Z-DNA参与基因表达的调控。

二、DNA的二级结构

1953年Watson和Crick提出了 DNA双螺旋结构模型。其要点是： ①DNA分子由两条反向平行的多核酸链围绕一共同中轴以右手螺旋方式盘旋而形成双螺旋结构。螺旋表面形成深沟与浅沟。这些沟状结构与蛋白质、DNA之间的相互识别有关。

②两链以磷酸与脱氧核糖为骨架，位于螺旋外侧；碱基位于螺旋内侧，碱基平面与脱氧核糖平面、中轴垂直。

③碱基对之间距离为0.34nm，每一螺旋含10个碱基对，旋距为3.4nm螺旋的直径为2nm，旋转的夹角为36℃。

④碱基通过氢键形成碱基对。A与T配对（两个氢键），G与C配对（三个氢键），称为碱基互补规律。碱基对之间的氢键及碱基平面之间的碱基堆积力是维持双螺旋结构稳定的主要力量。

三、DNA三级结构

DNA的三级结构指DNA双螺旋进一步盘曲所形成的复杂构象。 原核和真核生物线粒体、叶绿体DNA以正、负超螺旋形式存在。

组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个分子形成的八聚体组成，DNA分子的146个碱基对在此八聚体上盘绕2周。另54个碱基对与组蛋白H1结合，将各核小

核小体是染色质的基本组成单位，由200个碱基对

体颗粒连接起来，形成串珠样结构。此结构再进一步盘曲成直径为30nm的与5种组蛋白纤维状结构。后者再经几次卷曲，形成染色体的结构。

DNA功能：作为生物遗传信息的携带者，作为复制的模板将遗传信息传给子代；同时也作为基因转录的模板，展示个体生命现象。

组成。

第三节 RNA的结构与功能

RNA在生命活动中的作用是与蛋白质一同负责基因的表达过程的调控。RNA的结构多种多样，其功能也各不相同。

强调：DNA与RNA结构的不同点。 RNA由一条多核苷链组成。

一、信使RNA

mRNA的前体：mRNA的前体是不均一核RNA（hnRNA），其分子量比成熟的mRNA大，经剪接生成成熟的mRNA，并移位到细胞质。

MRNA结构特点与功能：

1．5′-端加帽：在5ˊ-末端加上一个7-甲基鸟苷二磷酸基，而第1个核苷酸的2位碳也甲基化，形成7-甲基鸟苷三磷酸帽子结构，此结构可保护mRNA免受核酸酶从5ˊ揣的降解作用，并在翻译起中起重要作用。

2．3′-端加尾： mRNA的3端有200多个腺苷酸残基的尾巴，′其作用在于增加mRNA的稳定性和维持其翻译活性。

3．mRNA功能：把DNA的遗传信息携带到细胞质，并在那里作为蛋白质合成的模板，决定其合成的蛋白质中氨基酸顺序。

各种RNA结构与其功能有密切联系。

各环的核苷酸序列差别较大，这是各种tRNA差异性所在。

二、转运RNA

tRNA结构特点与功能：

1、含较多的稀有碱基：每一分子常含有7～15个稀有碱基，如双氢尿嘧啶（DHU）、假尿嘧啶（ψ）和甲基化的嘌呤等。

2、tRNA三叶草形二级结构：由70～90个核苷酸组成的小分子RNA，共有100多种，其结构均是线性多核苷酸链。有四臂（螺旋区）、三环和1个附加叉（可变环）

嘌呤， 3ˊ-末端都是C-C-A-OH，在蛋白质生物合成时，氨基酸的羧基与3ˊ-未端羟基形成酯键相连。

3个环分别称DHU环、TψC

7个核苷酸组成，3、4、5三个核苷酸组成反密码，在蛋白质生物合成时，反密码可与mRNA上的密码借碱基配对而结合，识别相应的密码。

3、tRNA的三级结构呈倒L型：一端为氨基酸臂，L型的拐角处是DHU环和TψC环。

4、tRNA的功能：携带蛋白质合成所需的氨基酸，并按mRNA上的密码顺序“对号入座”地将其运转到mRNA分子上。

三、核蛋白体RNA

rRNA是细胞内含量最多的RNA，占细胞总RNA的90％。 rRNA结构特点与功能： 1、原核生物含3种rRNA：

其中23S与5S rRNA存在于大亚基，16S存在于小亚基。 2、真核生物含有4种rRNA：

其中28S、5.8S和5S存在于大亚基，小亚基只含有18S一种。 3、rRNA茎样二级结构：

原核生物与真核生物都含有的rRNA是：5SrRNA

各种rRNA的碱基组成无一定比率，不同来源的rRNA的碱基组成差

别很大。除5SrRNA外，其他的rRNA均含有少量稀有碱基，现已推测出

各种rRNA的结构均为茎样结构。

4、rRNA功能：

rRNA与蛋白质结合形成的核蛋白体是细胞内蛋白质合成的场所。

四、核酶

1、核酶的提出：

介绍：核酶的应用。

1982年Thomas Cech从四膜虫rRNA前体的加工研究中首先发现rRNA

2、锤头核酶：

R.H.Symons发现某些病毒和类病毒等最简单核酶二级结构呈锤头状，

于是提出了锤头核酶的概念。锤头核酶结构由3个茎和1～3个环组成，包 括催化部分和底物部分。核酶中有13碱基构成保守的核苷酸序列。锤头核

酶结构的发现促使人们设计并合成出许多种核酶，用以剪切破坏一些不害 基因转录出的mRNA或其前体，试图在抗癌和抗病毒方面发挥作用。

小结：

1、 DNA结构特点与功能。 2、三种RNA结构特点与功能。

第四节 核酸理化性质

复习： DNA和RNA结构特点与功能。

一、核酸的一般性质

1、核酸是两性电解质：含有酸性的磷酸基和碱性的碱基。因磷酸基的离子交换分离。

2、在碱性条件下，RNA不稳定：可在室温下水解。利用这个性质可以 测定RNA的碱基组成，也可清除DNA溶液中混杂的RNA。

3、核酸多是线性分子：由于DNA细长，其在溶液中的粘度很高，RNA分子比DNA短，在溶液中粘度低于DNA。

二、核酸的紫外线吸收

1、对核酸进行定量分析：核酸分子中的碱基都含有共轭双键，在260nm介绍：标准吸波长处有最大紫外吸收。

2、估计核酸的纯度：蛋白质在280nm波长处有最大吸收，可利用溶液260nm和280nm处吸光度的比值来估计核酸的纯度。对于纯的DNA和RNA来说，其A260/A280应分别为1.8和2.0，若有蛋白质和酚的污染，比值下降。

光度值为1时，各种标准浓度。

原因：G和C之间有3个氢键。

三、核酸变性与复性

（一）变性：指在某些因素的作用下，维系DNA双螺旋的次级键断裂（碱基堆砌力和氢键）双螺旋结构解开成单链的过程称为变性。

变性因素：加热和化学物质，如有机溶剂、酸、碱、尿素和酰胺等。实验中最常用的DNA的变性方法是热变性。

变性后的性质：粘滞度下降、紫外吸收值改变等。

DNA增色效应：变性使原来位于双螺旋内部的碱基暴露出来，造成在260nm处的紫外吸收值增高的现象。

Tm：是DNA双链解开50％时的环境温度。G＋C含量越高，Tm值越大；A＋T含量越高，Tm值越小。

（二）复性：DNA的变性是可逆的，当变性后，温度再缓慢下降，解开的两条链又重新聚合形成双螺旋结构。此过程也叫退火。

退火温度：复性的最佳温度是比Tm低25℃，若时间较长，可以复性至天然DNA的状态。若在DNA变性后，温度突然下调到4℃以下，复性则不能进行。这是保存变性状态DNA的良好方法。

分子杂交与PCR都是根据变性复性的原理设计的。

第五节 核苷酸代谢

核酸消化吸收：

食物中的核酸主要以核蛋白的形式存在。受胃酸的影响，核蛋白在胃中分解成核酸和蛋白质。核酸进入小肠后在胰液和肠液中的各种水解酶的催化下不断水解。

核苷酸的2条合成途径：

从头合成（肝）：合成是从氨基酸、一碳单位、CO2等小分子开始。 补救合成（脑和骨髓）：以嘌呤碱和嘧啶碱为原料合成。

嘌呤和嘧啶的分解代谢途径没有差别。

合成过程是耗能过程，由ATP供能。

6MP在临床上最常用。

MTX常用于治疗白血病。

一、嘌呤核苷酸的代谢

（一）嘌呤核糖核苷酸的合成 1．从头合成途径：

（1）5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）的合成：由ATP及5-磷酸核糖在PRPP合成酶催化下合成。

（2）次黄嘌呤核苷酸（IMP）的合成：PRPP先脱去焦磷酸而以核糖第一碳与来源于谷氨酰胺的-NH2相结合, 然后依次将甘氨酸、一碳单位、CO2等基团连接上去，生成次黄嘌呤核苷酸（IMP）。

（3）由IMP合成AMP和GMP 2．补救合成途径：

以PRPP和嘌呤碱为原料，经酶催化形成嘌呤核苷酸。 腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRT）：催化腺苷酸的合成。

催化IMP与GMP的合成。 HGPRT部分缺陷或完全缺陷：分别引起痛风和自毁容貌症（Lesh-Nyhan 3、嘌呤核苷酸的抗代谢物：可竞争性抑制嘌呤核苷酸的合成，从而进一步阻止核酸与蛋白质的生物合成，达到抗肿瘤目的。

嘌呤类似物：6-巯基嘌呤（6MP），6-巯基鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤等。 谷氨酰胺类似物：氮杂丝氨酸、 6-重氮-5-氧去甲亮氨酸等。 叶酸类似物：氨喋呤和甲氨喋呤（MTX）可竞争性抑制FH2合成酶。 （二）嘌呤核苷酸的分解代谢 分解部位：肝、小肠和肾。

分解过程：尿酸是嘌呤碱的最终代谢产物。

1、次黄嘌呤的生成：AMP和GMP首先分别脱氨和氧化脱氨生成IMP。IMP在核苷酸酶、核苷磷酸化酶的作用下生成次黄嘌呤。

嘌呤也可来自鸟嘌呤），再催化黄嘌呤进一步氧化生成尿酸。

3、痛风症：健康成人体内尿酸含量为0.12～0.36mmol/L。男性略高于女性。肾是其排泄器官。尿酸含量高于0.48mmol/L时，尿酸盐晶体沉积在关节、软骨、软组织和肾等处，导致关节炎、尿路结石及肾疾病。引起痛风症(gout)。

结构相似，故可抑制黄嘌呤氧化酶，从而抑制尿酸的生成。别嘌呤醇可与PRPP反应生成别嘌呤醇核苷酸，这不仅消耗PRPP，还作为IMP的类似物反馈抑制嘌呤核苷酸的从头合成。

看图说明：反应过程。

代谢与疾病：痛风症的发生与治疗。

强调：嘌呤核苷酸与嘧啶

二、嘧啶核糖核苷酸代谢

（一）嘧啶核糖核苷酸的合成 1．嘧啶核苷酸的从头合成：

不同于嘌呤核苷酸的是嘧啶环合成之后才与核糖磷酸结合。 利用天冬氨酸，谷氨酰胺、CO2，以合成氨基甲酰磷酸（由位于胞液中CPS-Ⅱ催化）为起点，合成嘧啶环。

（2）UMP和CMP合成：嘧啶核苷酸的核糖核酸部分也是由PRPP提供的，最先合成的是UMP。再从UMP转变为CMP（是在三磷酸核苷酸水平上进行的）。

2．嘧啶核苷酸补救合成：以尿嘧啶磷酸核糖转移酶最为重要。 （1）磷酸核糖转移酶催化嘧啶碱接受来自PRPP的磷酸核糖基。 （2）先与核糖-1磷酸反应，生成嘧啶核苷，后者在嘧啶核苷激酶催化下，磷酸化生成核苷酸。

3、嘧啶核苷酸抗代谢物

嘧啶核苷酸的抗代谢物是嘧啶、氨基酸或叶酸的类似物。（5-FU）是临床上常用的抗肿瘤药物。

（二）嘧啶核苷酸的分解代谢

胞嘧啶脱氨基转化成尿嘧啶，并继之再还原成二氢尿嘧啶。二氢尿嘧啶水解开环，最终生成NH3、CO2及β-丙氨酸。T通过类似的过程开环分解

核苷酸合成的不同点。

掌握：最终代谢物。

成NH3、CO2及β-氨基异丁酸而随尿排出。

β-氨基异丁酸进一步代谢或直接随尿排出，食入DNA丰富的食物或经放射线治疗或化学治疗的癌症病人，尿中β-氨基异丁酸等物的排出增多。

复习：碱基U和T的结构。

三、脱氧核糖核苷酸的合成

（一）脱氧核糖核苷酸的生成过程

脱氧核糖核苷酸由核糖核苷酸还原而来（核糖核苷酸还原酶）还原反应在二磷酸核苷水平上进行。

TMP）是脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP）经甲基化而生成的。由胸腺嘧啶核苷酸合成酶催化并需N，N－亚甲基四氢叶酸提供一碳单位。dUMP由dUDP水解或dCMP脱氨生成，以后者为主。

（二）脱氧核糖核苷酸的抗代谢物

FdUMP）

dUMP的结构相似，是胸苷酸合成酶的抑制剂，合TMP合成受阻。

TMP的合成。

CDP还原成dCDP，从而直接抑制DNA的合成。

5

10

5-FU、MTX、阿糖胞苷等常作为抗肿瘤药物。

四、核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸的相互转化

核苷三磷酸是合成核酸及贮存能量的活性形式。在特异的核苷一磷酸激酶的催化下，核苷一磷酸利用ATP作磷酸基的供体，转化为核苷二磷酸。

腺苷酸激酶催化AMP、ADP和ATP之间的相互转化。

核苷二磷酸与核苷三磷酸之间的相互转化是由核苷二磷酸激酶催化的。此酶的特异性没有核苷一磷酸激酶特异性高。

小结：嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的代谢。

五、核苷酸代谢障碍

参与核苷酸代谢的某些酶的先天性缺陷或调节机制异常可引起核苷酸代谢障碍。嘌呤核苷酸代谢的遗传缺陷较嘧啶核苷酸的多见。

痛风症：PRPP酶或HGPRT缺陷。 Lesch-Nyhan综合症：HGPRT完全缺陷。

免疫缺陷：腺苷脱氨酶（ADA）、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）缺陷。 肾结石：腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRT）完全缺陷。 黄嘌呤尿：黄嘌呤氧化酶完全缺陷。

第九章 本章主要内容：

基因信息的传递

复习提问导入新课：中心法则。

实验：重氮标记的大肠杆菌转入普通培养基中培养一代及数代。

举例： 大肠杆菌复制起始位点oriC结构。

本章以中心法则为线索，分三节讨论DNA复制，DNA转录合成各种RNA，以及mRNA翻译合成蛋白质。某些病毒的RNA也是遗传信息的携带者，也可复制。其中有些病毒的RNA还可以通过逆转录合成DNA，本章也作扼要介绍。

第一节 DNA的生物合成

一、DNA复制的特征

（一）半保留半不连续复制

半保留复制：在两个子代DNA分子中，分别有一条链来自亲代DNA另一条链则是新合成的，故称为半保留复制。

意义：DNA中储存的遗传信息正确无误的传递给子代，体现了遗传的保守性，是物种稳定的分子基础。

（二）有固定的复制起始点和共同特征

合部位；复制起始点有AT丰富的序列，使双链易解开。

真核生物染色体常具有多个复制起始点。 （三）双向复制

原核及真核细胞的DNA复制都是从复制起始点开始向两个方向进行的双向复制。

二、DNA复制的酶学

（一）DNA聚合酶

原核DNA聚合酶有三种，DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，作用不同。 真核生物中发现5种DNA聚合酶，α、β、γ、δ、ε。α和δ类似于Ⅲ，β类似于I。

由于DNA聚合酶的作用实现了DNA复制的保真性。

（二）解螺旋酶（helicase）

功能：是利用ATP提供的能量将DNA双螺旋解开。大肠杆菌中至少发现4种解螺旋酶，其中真正参与DNA复制时解螺旋的是DnaB。

（三）单链结合蛋白

功能：双链DNA解开成两条单链时，单链结合蛋白（SSB）能与它们结合，使它们不能再重新缔合成双链，并保护它们不受核酸酶降解。

（四）DNA拓扑异构酶

DNA具有双螺旋结构，在DNA复制中，这种紧密缠绕的结构必须解开，拓扑异构酶的作用能松弛超螺旋，从而克服扭结现象。

（五）引物酶

引物酶是一种特殊的RNA聚合酶，该酶以DNA为模板，催化一段引物RNA的合成。

（六）DNA连接酶

功能：能连接双链DNA中的缺刻，缺刻是指DNA双链中单链某处的3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键的断裂或两条相邻的单链片段之间尚未形成3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键。

使碱基之间的氢键断裂。

按照碱基互补原则合成一小段RNA片段。

三、复制过程

DNA（一）复制起始：

在解螺旋酶和拓扑异构酶Ⅱ的作用下使DNA解开一段双链，形成复制点（复制叉）。由于单链结合蛋白的结合，引物酶以解开双链的一段DNA为模板，以NTP为底物，合成一个短链RNA作用引物。

（二）复制的延长

在RNA引物的3′-OH端，DNA聚合酶Ⅲ催化四种dNTP，分别以两条链为模板同时合成两条新的DNA链。复制方向是5′→3′。

领头链：合成走向与解链方向相同的子链的合成是连续的。 随从链：合成走向与解链方向相反的子链的合成是不连续的。 引物的切除与缺口的填补：DNA聚合酶I以5′→3′外切作用去除RNA引物并以5′→3′方向延长DNA。

缺刻的连接：两个相邻的冈崎片段之间由连接酶连接。

（三）复制的终止

1、原核复制终止：复制终止时在拓扑异构酶II作用下，形成2个独立的子代环状DNA染色体。

2、真核生物的端粒与端粒酶能填补引物缺口：

真核染色体DNA末端有维持染色体稳定性和染色体DNA复制完整性的端粒结构。由重复的寡核苷酸片段组成。

端粒酶：是RNA与蛋白质的复合物，有逆转录酶的活性。

结合图讲解

病毒和动物病毒如甲肝

四、逆转录合成DNA（reverse transcription）

在RNA病毒中有逆转录酶，可以通过反转录作用合成DNA。

首先利用RDDP活性以RNA为模板，按碱基配对（U配A，G配C）大多数植物合成与RNA互补的DNA（cDNA解RNAcDNA单链为模板合成DNA.

病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）等。

五、DNA的损伤和修复

（－）DNA的损伤

一些物理、化学因子使细胞DNA在复制过程中发生突变，称为DNA损伤。引起损伤的主要因素有辐射（X射线、γ射线、紫外光等）、化合物（亚硝酸、烷化剂、嵌入剂如吖啶类染料、溴乙啶等）、DNA聚合酶的失误等。某些霉菌产生黄曲霉素，香烟中和熏制食品中的苯骈芘也是致癌的。

（二）DNA损伤的修复

切除修复是细胞内最主要的修复机制。 1．光修复（photoreactivation）：

用300～600nm波长的光照激活光裂合酶，使相邻的胸腺嘧啶二聚体解聚。

2．切除修复（exision repair）：这是将损伤或错配部位除去，重建正确的结构。

3．重组修复：重组是指遗传物质DNA片段在染色体内或染色体间进行交换的过程。

4．SOS修复：

当DNA分子受到严重损伤，上述组成性修复机制都不足以修复时，细

经SOS修复后产生广泛

的突变。 胞就经诱导而紧急动员起来产生一种应急性修复反应，称它为SOS修复。

第二节 RNA的生物合成

一、模板和酶

（一）转录模板

基因只占

转录具有不对称性：基因的两条DNA链中一条链上储存有遗传信息，DNA的一小称编码链，另一条与编码链互补，是转录模板，称模板链。

（二）RNA聚合酶（DDRP）

DDRP以DNA为模板，4种NTP为底物，尚需Mg2+或Mn2+等二价金属离子。RNA的合成沿5′→3′方向延伸。

1、原核RNA聚合酶：由四种五个亚基构成，其中δ去除了δ因子的全酶就称为核心酶。可合成三种RNA。

2、真核RNA聚合酶：有三种不同的RNA聚合酶，I和II分别负责合成rRNAt和mRNA，III负责5sRNA和mRNA。

部分。且只有少部分基因被转录。

以原核生物为例说明。

二、转录过程

1、起始阶段

RNA聚合酶全酶（δ因子起重要作用）识别启动子并与之结合。使模板DNA起始部位双链解开约12bp。在模板的指导下合成9个左右核苷酸的RNA，在此之后δ因子脱离全酶。核心酶离开启动子，向下游移动。

2、延长阶段

RNA核心酶沿模板3′→5′方向滑动，沿5′→3′方向合成RNA。打开的双链区长度约为17个碱基对，结合区的长度约为12个碱基对。前方的双链逐步解开，后方的双链重新缔合。

3、终止阶段

RNA聚合酶到达基因终止子时，合成的RNA链被释放，当到达有ρ（rho）因子或富含GC碱基及倒转重复顺序形成茎环结构附近时，转录终止。

三、转录后加工（post-transcriptional processing） 三种 RNA 结 RNA前身转录初产物（primary transcripts）经酶促反应形成成熟RNA

构特点就是经转录加工形成的。

的过程称为转录后加工。这是基因表达的必经过程之一，在基因表达的调以及5′-端、3′-端特异的核苷酸修饰、剪接等。

第三节 蛋白质的生物合成——翻译

翻译的概念：把mRNA中的核苷酸链中的遗传顺序表达为蛋白质分子中氨基酸排列顺序的过程称为翻译。

复习：DNA复制过程，RNA合成过程。

一、遗传密码

密码子（codon）： mRNA分子上，从5′→3′方向，每三个核苷酸决定一种氨基酸，三联核苷酸就称为密码子。

四种碱基可排列组成43=64个不同的密码子，遗传密码由64个密码子组成。这些密码子不仅代表了20种氨基酸，还决定了翻译过程起始和终止的位置。

遗传密码具有以下特点：

（一）通用性：目前这套密码，基本上通用于生物界所有的物种，但近十年来的研究表明在线粒体以及某些原生动物中，密码并不完全相同。

（二）简并性：

终止密码或无意义密码子：UAA、UAG和 UGA， 起始密码子：AUG既是蛋氨酸的密码子， 简并性：除了蛋氨酸和色氨酸各有一个密码子外，基余18种氨基酸每种至少有2个密码子。简并性就是指几个密码子都决定一种氨基酸。

决定同一种氨基酸的密码子中头两个核苷酸往往是相同的，只是第三个碱基不同。表明密码子的特异性往往由头两个核苷酸决定，第三个核苷酸不太重要。

（三）连续性：mRNA中的起始密码子之间的序列是编码序列，也称它为阅读框架。从5′端起点开始，向3′端一个一个连续不断的阅读，直至终止密码为止。

如在mRNA单链上加上或删去一个碱基，就会引起读码发生错误，这种加上一个碱基或删去一个碱基的过程叫移码，移码可引起突变。

（四）摆动性：密码子的第1、2位碱基分别和反密码子第3、第2位碱基配对。它们遵循A配U，G配C规则，但密码子中的第3位碱基与反

摆动配对： I与A，C，U；U与A，G；

密码中的第1位碱基有时会出现不遵循上述规则的情况，从而使一种tRNAG与A，U。 的反密码子可以与决定同一种氨基酸的不同遗传密码子配对结合，称摆动性，可以产生不寻常的碱基配对部位称摆动位。

二、蛋白质生物合成体系

（一）翻译模板

真核生物mRNA的5′端为到3′端依次是帽子、5′揣不译区、编码区、3′端不译区和多聚腺苷酸尾巴，编码区只含一种蛋白质的编码序列。

（二）转运氨基酸tRNA

tRNA一端是反密码子，能识别mRNA中的密码子并且与它配对结合； 另一端能与氨基酸共价结合。

tRNA与氨基酸是由氨基酰tRNA合成酶催化的，该酶有绝对专一性。 合成反应分两个步骤：第一步是氨基酸被ATP-E活化成氨基酰-AMP-E,第二步是活化的氨基酸与tRNA结合。

（三）肽链合成场所核蛋白体

原核生物5′端为pppPu，（小亚基辨认序列）

复习：氨基酸臂和反密码环。

核蛋白体由大小两个亚基组成，大亚基上有转肽酶活性，大亚基上还多聚核蛋白有两个tRNA结合位点，一个是P位，是翻译起时蛋氨酰tRNA或结合肽酰-tRNA的部位，另一个是A位，是结合氨基酰-tRNAmRNA结合的部位，使mRNA能附着于核蛋白体上，使遗传密码能逐个被翻译成氨基酸。

体：mRNA和多个核蛋白体的聚合物。

三、蛋白质生物合成过程

肽链合成的方向是从N端到C端，翻译分为起始、延长和终止三阶段。 （一）翻译起始

1、 起始因子IF-3和IF-1与核蛋白体结合，使大小亚基分离。

2、mRNA与小亚基结合:mRNA上的SD序列和小亚基中16s rRNA3′SD序列：端嘧啶核苷酸丰富的序列配对结合，再与小亚基的蛋白质结合。

3、fmet-tRNAfmet

就位：fmet-tRNAfmet和起始因子

IF-2及GTP形成

mRNA起始密码子上游的嘌呤核苷酸丰富的序列。

复合物，与mRNA的起始密码子配对，结合到小亚基上。

4、核蛋白体大小亚基结合：fmet-tRNAfmet就位后，起始因子IF-3就脱离小亚基，核蛋白体50s大小基与小亚基结合成70s起始复合物，fmet-tRNAfmet占据P位，与此同时GTP水解，IF-1和IF-2脱离起始复合物。

（二）翻译延长

翻译延长分为：注册、成肽和转位。

1、注册（进位）：氨基酰-tRNA根据mRNA中密码子的指引，在EF-Tu

肽消耗的高能磷酸键。 1＋19＊2＋1

合成20及GTP等参与下，进入核蛋白体的A位，与mRNA结合。GTP成GDP。 举例：

2、成肽：在大亚基组分之一的转肽酶催化下，P位上蛋氨酰-tRNA中的蛋氨酰基转移并通过其活化的羧基与A位上氨基酰-tRNA中氨酰基的a

氨基结合，形成第一个肽键，这样在核蛋白体A位生成了一个二肽酰-tRNA＝40个。

＋

P位上的tRNA从核蛋白体上脱落下来。转肽过程需要Mg2+和K。

3、转位：在EF-G、GTP和Mg2+的参与下，GTP分解供能，使核蛋白体沿mRNA向3′-端移动一个密码子，这样，P位上空载tRNA离开核蛋白体，A位上二肽酰tRNA进入P位，新进入A位的密码子又可接受氨基酰tRNA 注册。

就这样进位、成肽、转位反复进行，肽链就按遗传信息所编码的氨基酸顺序不断延长，直到出现终止信号为止。

（三）翻译终止

当肽链合成至A位上出现终止信号的密码子时，翻译因子RF-1或RF-2在RF-3的辅助下与相应的终止密码子结合，使转肽酶将P位上肽酰tRNA中肽链转移给水分子。在此过程中水解GTP 使tRNA、释放因子及mRNA离开核蛋白体。

（四）真核与原核蛋白质生物合成过程的异同

1、翻译起始因子种类多，用eIF表示，起始过程较原核复杂。 2、翻译起始时

met-tRNAimet、起始因子

eIF-2和GTP三者形成的复合

物先和40s小亚基结合，然后才是mRNA就位。

3、真核mRNA在核蛋白体小亚基上就位的机制不同于原核。先由帽子结合蛋白与真核mRNA5′端帽子结合，然后在一些真核起始因子的辅助下才能与小亚基结合。mRNA5′端与小亚基结合之后，还有迁移过程。

四、翻译后加工

（一）翻译后的加工修饰 1．N端加工：

新生的多肽链N端在原核中为甲酰蛋氨酸，在真核中为蛋氨酸。蛋白端的蛋氨酸甚至N端的一段肽链。

2．氨基酸残基的修饰：

氨基酸的修饰方式很多，常见的有乙酰化、羟基化、二硫键形成、磷酸化和糖基化。

3、水解加工：水解除去部分肽段后才能成熟。

4．亚基的聚合和辅基的连接：多肽链合成之后还需要进行肽链之间的聚合和肽链与辅基的结合。

（二）分泌性蛋白质的跨膜转运

分泌性蛋白质首先合成的是N端的信号肽，胞液中的信号识别颗粒（SRP）能识别信号肽并与之结合，导致翻译暂停。内质网膜上的SRP受体与SRP结合，从而介导核蛋白体与内质网膜结合，使SRP与信号肽及SRP受体分离，翻译又能进行。

在内质网膜中的蛋白质转位装置的介导下，信号肽引导新生的多肽链穿过内质网膜进入内质网腔，

新合成的肽链不一定具有生物活性，要经过加工后才能成为具有天然构象的活性蛋白质。

研究意义：研制能有效抑制病原微生物或肿瘤细

五、蛋白质生物合成与医学的关系

（一）分子病

分子病：由于基因的遗传缺陷使表达的蛋白质结构异常和功能障碍，从而造成的疾病称为分子病。目前已知有五千多种。

镰刀形红细胞贫血：点突变T变为A，导致血红蛋白β亚基中第6位氨基酸残基由正常的谷氨酸被缬氨酸取代。

（二）蛋白质生物合成的抑制剂

1、抗生素：抗生素是某些真菌的代谢产物，可作用于复制、转录和翻译的各个环节，通过阻抑细菌或肿瘤细胞的蛋白质合成。从而起到抑菌和抗癌等作用。如四环素、氯霉素、链霉素和卡那霉素等。

2、白喉毒素：白喉毒素由白喉杆菌产生，是一种酶，能将NAD中ADP核糖基转移到真核延长因子-2（EF-2）中特异的氨基酸残基上，使EF-2失活，从而阻断翻译。

3、干扰素：干扰素是一组小分子糖蛋白。病毒产生的双链RNA能诱导宿主细胞生成干扰素，产生的干扰素能诱导特异的蛋白激酶，活化的蛋白激酶又可促使eIF－2磷酸化而失活，从而抑制病毒蛋白质的合成；另外干扰素还可间接活化特异铁核酸内切酶，降解病毒。

＋

胞而对人体或正常细胞毒性较小的药物。

小结：本节重点内容。

第十章 基因结构与基因表达调控

第一节 基因与人类基因组计划

一、基因

（一）原核基因的结构特点

操纵子（operon）：原核生物的功能相关的基因组合在一起，形成一个转录单位，受相同因素调控，称操纵子。

操纵子的结构：从5′端到3基因和终止子。

启动子和操纵序列是调控区，分别与RNA聚合酶和调节蛋白结合；结

（二）真核基因的结构特点

调控区：RNA聚合酶和基本转录因子组成的转录起始复合物及活化因子结合的部位。

编码区：外显子和内含子相间排列，真核基因是断裂基因。 （三）基因表达方式

组成性基因表达：某些蛋白质生命全过程都需要，是管家基因，它们的表达是持续的，不受调控。

有一些蛋白质只是在生命过程中某个时期或者为了适应外界环境才需要，编码这些蛋白质的基因的表达是受调控的。

转录产物： 内部有多个蛋白质编码区的多顺反子mRNA，翻译后得到多种蛋白质。

转录产物： 单顺反子mRNA，翻译后得到一条多肽链。

原核：4200多个基因。

二、基因组（genome）

一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因称基因组。人类基

因组指22条常染色体和X、Y 人类：3万多

三、人类基因组计划（HGP）

1986年提出，1991启动，2001年2月取得重大成果，完成了90％以上的人类基因组测序工作，制作了包括全部编码序列在内的工作草图。

（一）人类基因组分析的主要内容

1、遗传图的制作；2、物理图的制作；3、转录图的制作；4、基因序列测定。

（二）人类基因组研究在医学上的价值

对认识疾病的分子机制以及诊断和治疗疾病作出重大贡献。

个基因。

第二节 原核生物操纵子转录调控模式

编码物质代谢酶类的操纵子分为两类：

一类是编码分解代谢酶操纵子，当环境中存在酶的底物时，才表达。 这些操纵子是不表达的。

负性及正性调节互相协调，保证原核生物首先利用葡萄糖，只有当葡萄糖不存在时才

一、乳糖操纵子（lac操纵子）转录调控机制

（一）乳糖操纵子的结构

从5′端到3′端依次为调控区：CAP位点、启动子（P）和操纵序列（O） 结构基因位于调控区下游，有Z、Y和A三个编码乳糖代谢有关的酶的基因。

（二）阻遏蛋白的负性调节

环境中不存在乳糖时：操纵子是关闭的。i基因产物I蛋白能特异地和操纵序列O结合，阻碍RNA聚合酶与启动子P结合，抑制转录起始。

存在乳糖或人工合成的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）时：去阻遏作用。 能利用乳糖，乳糖能被原先存在的极少量β-半乳糖苷酶转变为别乳糖，别乳糖或IPTG能和I蛋白结合，使之改变构象，不能再和O序列结合，

（三）CAP-cAMP的正性调节

葡萄糖分解时能抑制cAMP合成，它通过降低cAMP浓度而阻遏乳糖操纵子转录，从而抑制乳糖分解。这种作用称为分解代谢阻遏。

葡萄糖分解完毕后cAMP含量上升，cAMP能和CAP结合形成复合物，该复合物能乳糖操纵子调控区中的CAP位点结合，通过CAP和RNA聚合酶之间的蛋白质-蛋白质相互作用促进转录起始。

是一种合理的、节能的调控机制。

二、色氨酸操纵子(trp操纵子)调控机制

（一）色氨酸操纵子结构

氨酸合成代谢途径中的酶的基因。

（二）阻遏调控

环境中不存在色氨酸时：操纵子是开放的，细菌可能自己合成色氨酸。 环境中存在色氨酸时：色氨酸与色氨酸阻遏蛋白基因（trpR）的产物RNA聚合酶与启动子结合，从而阻遏操纵子转录，细菌不再合成色氨酸，但阻遏作用并不完全，仅能阻遏70％。

（三）转录衰减

转录起始位点位于前导序列之中，因此首先转录出161个核苷酸的前导RNA序列。它主要包括含有2个色氨酸密码子的前导肽编码序列和4段特异的互补序列。

由于转录和翻译偶联，从刚合成的前导RNA上起始翻译时，转录还在进行之中，若环境中有较多的色氨酸，细菌能合成色氨酰-tRNA，核蛋白体顺利的完成前导RNA的翻译，到达前导肽的终止密码子，刚好覆盖序列1和序列2，此时RNA聚合酶转录出的序列3和序列4能形成发夹结构，其下游是一串U，构成终止子，使操纵子转录尚未进入结构基因就终止。若环境中缺乏色氨酸，无色氨酰-tRNA，前导RNA翻译时核蛋白体停留在色氨酸密码子处，只覆盖序列1，转录能继续延长，色氨酸操纵子可以表达。

小结：转录衰减辅助阻遏调控，使表达调控更精确。

一般将启动子启动子近端元件作为真核基因的调控区。

第三节 真核基因转录调控

包括染色质活化，基因转录、转录后加工、翻译及翻译后加工等各个阶段的调控，其中转录阶段的调控最重要。

一、顺式作用元件

按功能分为四类：启动子、启动子近端元件、增强子和沉默子。 1、启动子：是RNA聚合酶和基本转录因子识别和结合的部位，它们

2、启动子近端元件：位于转录受调控的II型启动子的起始上游100～200bp范围内，是序列特异的短片DNA，如GC盒、CAAT盒等。特异的在启动子处的转录起始复合物。

3、增强子：长度为100～200bp的含有特异的重复的DNA短片段，其中有一些就是启动子近端元件。也是特异的转录活化因子结合部位。

4、沉默子：是负性调控元件，与增强子一样可以远距离作用。特异的蛋白质因子与沉默子结合后抑制基因转录起始。

增强子和沉默子都可以远距离作用。

二、反式作用因子

反式作用因子是能与顺式作用元件特异地结合的蛋白质。 1、分类：

根据功能分为两类：基本转录因子和特异转录因子。

基本转录因子：RNA聚合酶与启动子结合，并且在启动子处组装成转录起始复合物所必需的一组蛋白质因子。

特异转录因子：因子和抑制因子，前者与启动子近端元件或增强子结合，后者与沉默子结合，分别起活化和抑制转录的功能。

2、 转录活化因子的结构：

有两个功能域：DNA结合域和转录活化域，还有二聚化功能域。 DNA结合域：常见的有以下两种。

（1）锌指结构：可插入顺式元件的DNA大沟之中。 （2）亮氨酸拉链：可与顺式元件的大沟结合。

转录活化域：根据氨基酸的组成分为：酸性活化域、脯氨酸富含域和谷氨酰胺富含域.

介绍：基本转录因子和特异转录因子的功能。

真核基因表达最基本的环节，它的调控包括三个水平。

二聚化域：起二聚化作用，如亮氨酸拉链中的含有亮氨酸的α螺旋区。 转录起始是

三、真核基因转录调控的三个水平

1、染色质水平：

某些蛋白质因子能利用ATP供能使核小体中的组蛋白解离，某些转录活化因子介导组蛋白乙酰化，这些都有利于转录起始复合物的组装和转录活化因子与顺式作用元件结合。

2、转录活化因子的活化和表达：

转录活化因子本质是蛋白质，本身与存在活性状态和无活性状态。信号转导过程中某些转录因子磷酸化或与类固醇激素结合后可被活化，从而起活化受其调控的基因的转录的作用。转录活化因子本身也是基因表达的产物，因此它们的表达也关系到受其调控的基因的转录，这些调控在胚胎发育中特别重要。

3、转录起始复合物的组装和活化；

因操纵子转录调控模式。

在体外实验中发现转录活化因子能促使转录起始复合物在启动子处的小结：原核基组装，可能在活体内也存在这种调控。在表达受调控的基因中转录起始受到结合在启动子端元件上的转录活化因子的活化，某些基因还受到结合在增强子上的转录活化因子的活化。这些反式作用因子通过与转录起始复合物蛋白质-蛋白质相互作用而促进转录起始。

第十一章 癌基因、抑癌基因与生长因子

肿瘤的发生是由于细胞增殖与分化的调节基因失衡所导致的细胞恶性生长现象。细胞的增殖生长由两类基因调控。

一类是：促进细胞生长和增殖，阻止终末分化的癌基因。另一类是：促进分化、抑制增殖的抑癌基因。当这两类基因的任何一种或两种发生变化，即可引起细胞失控，导致肿瘤发生。

此外，癌基因可编码类生长因子及其受体，刺激细胞增殖。

肿瘤的发生与癌基因、抑癌基因及生长因子不密切关系。

除逆转录病毒所具有的结构外含

第一节 癌基因（oncogene）

癌基因：能在体外引起细胞转化、在体内诱发肿瘤的基因。其名称一般用3个斜体小写字母表示，如myc、rac、src等。

一、病毒癌基因

鸡肉瘤病毒（RSV）：1911 RSV基因组结构：

src基因：与RSV诱发肿瘤有关，称癌基因，被命名为v- src。目前已在鸡类和哺乳类动物中发现这类病毒约为40种。

二、细胞癌基因（cell-oncogene, c-onc）

原癌基因（pro-onc）：将存在于生物正常细胞基因组中的癌基因同源序列称原癌基因或称细胞癌基因。

正常情况下，这些基因处于静止或低表达状态，对维持细胞正常生长分化和凋亡起重要的调节作用。但当受到致癌因素刺激则可转变成为具有转化细胞活力的癌基因。

src。

LTR内有较强的启动子和增强子。

三、癌基因活化的机制

细胞癌基因在病毒感染、化学致癌物质或辐射作用等条件下，可被激活。激活的方式主要有以下四类。

（一）获得启动子与增强子

基因附近或内部，可以启动下游邻近基因的转录和影响附近结构基因的转录水平。从而使原癌基因过度表达或由不表达转为表达，导致细胞发生癌变。

（二）基因易位

在肿瘤组织，染色体易位的过程中发生了某些基因的易位和重排，使例：人Burkitt而原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。

（三）原癌基因扩增（amplification）

指原癌基因数量的增加或表达活性的增强，产生过量的表达蛋白导致肿瘤发生。

（四）点突变（point mutation）

突变，从而改变了蛋白的氨基酸的组成，造成蛋白质结构和功能的异常，引起细胞增殖癌变。

蛋白质量表达升高几十甚至上千倍。

淋巴瘤细胞。

癌基因可根据原癌基因的表达产物

四、癌基因的分类与功能

1、src家族：它们含有相似的基因编码结构，其产物具有酪氨酸磷酸

2、rac家族：P21在细胞是的具有GTP酶活性，可与GTP结合，并使水解，参与cAMP水平的调节。

3、myc家族：转录的作用。

4、sis家族：只有一人成员，编码P28蛋白，能刺激间叶组织的细胞

5、myb家族：编码核蛋白，能与DNA结合，为核内的一种转录因子。 癌基因表达产物按其在细胞信号传递系统中作用分成四类： 1、生长因子类：生长因子的过度表达，势必连续不断作用于相应的受体细胞，造成大量生长信号的持续输入，从而使细胞增殖失控。

2、生长因子受体类：另一类原癌基因的产物跨膜受体，受体的胞质结构区域均具有酪氨酸蛋白激酶活性，它们能接受细胞外的生长信号并将其传入细胞内。

3、细胞内信号转导物类：参加细胞内信号传递，促进细胞生长。 4、核内转录因子类；某些癌基因表达产物定位于细胞核内，它们能把靶基因的调控元件结合，直接调节转录活性，起转录因子作用。

定位和功能分为五类。

癌基因编码的蛋白与细胞生长调控的许多因子有关。

第二节 抑癌基因（anti-oncogene）

一、抑癌基因的基本概念

值得提出的是：所谓“癌

抑癌基因又称抗癌基因：是一类抑制细胞过度生长增殖从而遏制肿瘤基因”、“抑癌形成的基因。

在正常细胞中抑癌基因与原癌基因共同调控细胞生长分化。当细胞生长到一定程度时，会自动产生反馈抑制，抑癌基因高表达，原癌基因不表达或低表达。当癌基因激活与过量表达则肿瘤形成。同时，抑癌基因的丢失或失活也可导致肿瘤发生。

基因”是在癌瘤研究过程中命名的，事实上它们均是细胞的正常基因成分，具有重要的生理功能。

二、常见的抑癌基因

目前定论的抑癌基因有10余种。

三、抑癌基因的作用机制

（一）视网膜母细胞瘤基因（Rb基因）

Rb基因：当Rb成视网膜细胞瘤，它的失活还见于骨肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌等。

Rb化形式为活性型，能促进细胞分化，抑制细胞增殖。

机理：其抑制作用与转录因子（E-2F）有关。它是一类刺激转录作用的活性蛋白。当Rb基因发生缺失或突变，丢失结合、抑制E-2F的能力，细胞增殖活跃，导致肿瘤发生。

（二）P53

P53蛋白含393个氨基酸，在体内以四聚体形式存在，分三个结构域 1、核心区：位于P53蛋白分子中心，包含有结合DNA的特异性氨基酸序列；2、酸性区：由N端1～80位氨基酸残基组成，含有特殊的磷酸化位点；3、碱性区：位于C端，P53蛋白通过这一片段可形成四聚体。C端可以单独具备转化活性，起癌基因作用，且有多个磷酸化位点，为多种蛋白激酶识别。

当P53发生突变后，由于空间构象改变影响到转录活化功能及P53蛋白的磷酸化过程，这不仅失去野生型P53抑制肿瘤增殖的作用，而且突变本身又使该基因具备癌基因功能。

第三节 生长因子

一、生长因子概述

概念：又称细胞生长调节因子，是一类能促进靶细胞增殖生长等细胞效应的多肽类物质。包括细胞生长因子及细胞生长抑制因子。

生长因子按其性质功能分成7类：

表皮生长因子；神经生长因子；成纤维细胞生长因子；血小板源生长因子；胰岛素样生长因子；造血细胞生长因子；白介素类细胞因子。

生长因子对靶细胞作用方式有三种模式：

1、内分泌：生长因子从细胞分泌后，通过血液运输作用于远隔靶细胞。

以旁分泌和自分泌，两种

2、旁分泌：细胞分泌的生长因子作用于邻近的其他类型细胞；3、自分泌：方式为主。 生长因子作用于自身的细胞。

教法：通过生长因子作用机制示意图。

二、生长因子作用机制

其作用依赖于靶细胞膜上的相应受体的信号传递。

生长因子受体是一类跨膜糖蛋白，分为膜外域、跨膜域及胞内域，后者具有酪氨酸激酶活性。

当生长因子与受体结合后，通过受体自身磷酸化启动受体酪氨酸激酶的活化，或者借助与其偶联的胞浆酪氨酸激酶的催化胞内的一系列相关底物蛋白质磷酸化。激活细胞膜上磷脂酶C，水解磷脂酰肌醇磷酸酯，产生IP3、DAG和Ca2+等相应的第二信使，活化蛋白激酶或胞内相关蛋白质，包括核内的转录因子，引发基因转录，达到调节生长与分化的作用。

小结：重点内容。

三、生长因子与疾病

（一）细胞凋亡（apoptosis）

细胞凋亡是在某些生理或病理条件下，细胞受到某种信号所触发，经过一系列信号转导、基因改变、酶激活等复杂过程启动细胞自杀程序引起细胞死亡的过程，对控制细胞增殖、防止肿瘤的发生有重要意义。

（二）动脉粥样硬化

是一种以细胞增殖和变性为主要特征的疾病，癌基因表达比正常组织高约5～12倍。

（三）心肌肥厚 癌基因存在于正常心肌、血管平滑肌和内皮细胞中，为血管生长发育所需。

第五节 基因工程与聚合酶链反应 一、基因工程

基因工程（gene engineering）主要是通过类似工程设计的方法，将所获得的目的基因在体外与基因载体重组，然后把它引入适当宿主细胞中，随着该细胞的繁殖，DNA重组体得到扩增，成为能产生引入DNA片段的克隆（clone），并同时得以表达，这样就可以获得大量该基因编码的相应产物。所以基因工程技术也常称之为重组DNA（recombinant DNA）技术，或称为基因克隆（gene cloning）技术。基因工程技术对生物学、医学、药学、免疫学以及农牧业生产实际均有重大意义。

（一）限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶是基因工程必需的工具酶，目前已知的限制性核酸内切酶有400余种，主要是从细菌中提取的，作用于双链DNA，具有高度专一性，能识别的核苷酸序列通常是4～6个碱基对，大多数识别序列具有倒转的重复顺序，在此特异的识别位点切断双链DNA，多数在DNA两条链上的切口是错开的，切开后两端单链的碱基部分称为粘性末端，同一种限制性内切酶所产生的粘性末端是相同的，相同的粘性末端的碱基具有互补性，通过连接酶可把它们连接起来，因而，具有粘性末端的DNA片段容易结合进载体DNA分子中。

（二）克隆载体

克隆载体（cloning vector）是指能够携带和转运特定的DNA片段的特殊载体，这些载体本身也是DNA，能够在宿主细胞中复制，并具有抗药性等遗传特性。常用的载体有三类：质粒、λ噬菌体和DNA病毒。质粒是双链闭环DNA，存在于细菌细胞中，细菌对抗生素的抗药性，往往取决于质粒的存在与否，目前常用基因载体的质粒有PBR322、PSC101等；噬菌体是细菌的病毒，在一定的细菌中可以复制，大肠杆菌λ噬菌体是由48502

个碱基组成的。这些载体在限制性核酸内切酶作用下造成切口，使基因片段组合进

载

体

DNA分子中，然后进入宿主细胞内进行表达。

（三）基因工程的主要步骤

1．构建DNA重组体 2．将重

组

体

DNA引入宿主细胞 3．筛选含有重

组

体

DNA的细菌

4．鉴定目的基因的表达

（四）

基因工程在医学上的应用

基因工程技术是近代生物科学的一项重大发展，除了在工农业、环境保护等方面的应用外，在医药学方面也有广阔的应用前景。

二、聚合酶链反应

聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）是近几年发展起来的一项快速体外基因扩增技术，此技术自1985年建立以来，被广泛用于特异DNA序列的扩增、人类遗传病的诊断、传染病病原体的检测、癌基因及法医学方面的研究。