叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度。即可用公式计算出提取液中各 色素的含量。
根据朗伯-比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质溶度C和液层厚度L成正比,即:A=αCL
式中:α比例常数,当溶液浓度以百分浓度为单位、液层厚度为1cm时,α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、叶绿素b在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、叶绿素b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
由于,叶绿素a和叶绿素b的80%丙酮提取液在红光区的652nm的吸收峰相交,两者有相同的吸光系数(均为34.5),可以再此波长下测定一次吸光度(A652)而求出叶绿素a和叶绿素b的总量:CT=(A652*1000)/34.5 (1)
二、 材料、仪器设备及试剂
(一) 材料
新鲜(或烘干)的植物叶片
(二)
① 仪器设备 分光光度计;②电子顶载天平(感量0.01g);③研钵;④棕色容量瓶;⑤小漏斗;⑥定量滤纸;⑦吸水纸;⑧擦镜纸;⑨ 滴管
(三) 试剂
1.95%乙醇(或80%丙酮)。
2.石英砂。
3.碳酸钙粉。
三、实验步骤
⑴取新鲜生菜叶片或干材料,擦净组织表面污垢,去掉中脉,用液氮速冻。
⑵称取速冻后的新鲜样品0.2g,共三份,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及95%乙醇2到3ml(或80%丙酮,以下同),研磨成匀浆,再加95%乙醇10ml,继续研磨至组织变白。静置3到5分钟。
⑶取滤纸一张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25ml棕色容量瓶中,用少量95%乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。
⑷用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml,摇匀。 ⑸ 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯中。以95%乙醇为空白,在波长652nm下测定吸光度(如用丙酮提取,波长应
调整)。
四、实验结果计算与分析
按公式(1)计算出叶绿素a和叶绿素b的浓度。求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量(用mg/g鲜质量或干质量表示):叶绿体色素的含量(mg/g)=C*V*N/(W*1000)
式中:C为色素含量(mg/L);V为提取液体积(ml);N为稀释倍数;W为样品鲜质量或干质量(g);1000即1L=1000ml。
五、注意事项
⑴为了避免叶绿色的光分解,操作时应在弱光下进行,研磨时间尽量短。
⑵叶绿体色素提取液不能混浊。可在710nm或750nm波长下测量吸光度,其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时吸光度值得5%,否则应重新过滤。
⑶用分光光度计法测定叶绿素含量,对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm,则叶绿素a的测定误差为2%,叶绿素b为19%,使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外,还应以纯的叶绿素a和叶绿素b来校正。