马铃薯的组织培养

青岛农业大学课程论文

马铃薯的组织培养

姓名：秦 聪 学号：20122832

专业：电气工程及其自动化

中国•青岛

摘要：马铃薯是我国的重要粮食产物之一，

但有于病毒污染，基因退化等，导致马铃薯产量降低，但随着组织培养技术的逐渐成熟，已经可以实现大规模生产脱毒的幼苗。掌握马铃薯的组织培养的基本原理了解影响培养结果的因素，有利于完善培养技术，

解决马铃薯组织培养过程中的常见问题。关键词：马铃薯 组织培养 培养过程 注意事项 前言

马铃薯组织培养（PlantTissueCulture ）：是指通过无菌操作分离马铃薯体的一部分（外植体explant ），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。（主要有原生质体（Protoplast ），悬浮细胞，组织（愈伤组织Callus 、茎尖分生组织），器官（胚，花药，子房，根和茎）的培养。其中最常见的是愈伤组织培养。）

组培意义：1、基础理论研究（试验体系的准确性和可重复性，广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究（如分化问题））。2、应用研究（无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化，遗传育种，种质保存，克服远缘杂交，种质资源创新，获得转基因植株）。

组培应用前景：1、作物育种上的应用（1、花药和花粉培养2、胚胎培养3、细胞融合4、基因工程5、培养细胞突变体6、种质保存）2、作物脱毒和快繁上的应用（马铃薯，兰花）3、在马铃薯有用产物生产上的应用4、在遗传、生理、生化和病理研究上的应用。 正文

1基本流程 1、表面灭菌 由于在培养基上，真菌和细菌的生长远远快于马铃薯试材，导致过盛生长而杀死植株。因此。接种前应对材料进行彻底的表面消毒，淘汰内部已受到真菌和细菌侵染的材料。针对马铃薯的取用部位，确定灭菌剂种类、浓度及处理时间，以达到彻底消除病菌又不杀死马铃薯材料的目的。

2、愈伤组织诱导、脱毒及芽分化

诱导愈伤组织的培养基以MS 为基本培养基，加入适宜浓度的激素。 3、芽的继代

更换培养基的配方，调整激素和其他营养的浓度，将诱导的丛生芽分离，将其中生长态势良好的马铃薯小苗转接至生根培养基，其余的单芽再行继代培养。 4、生根培养

将单株马铃薯小苗转接生根培养基进行培养。

5、炼苗及移栽 将生长旺盛、根系发达的试管苗移入常温室内打开瓶盖放置一段时间，然后移入栽培基质中温室培养。 2 具体步骤 1、表面灭菌 消毒方法：冲洗马铃薯材料除去泥土等大的颗粒→浸入70-75％乙醇，有利于马铃薯表面的浸湿→用5-20％NaClO 溶液（加1滴表面活性剂）表面消毒5-10min →用无菌水冲洗至少3遍→与消毒剂接触过的切面在转移到无菌培养基前应切去，因为消毒剂会杀死外露的细胞从而影响营养吸收→切取外植体，通常为10mm 的茎段和直径10mm 的叶片部分（太大激素作用减弱，太小则不易成活）。

消毒注意事项：1、表面消毒剂对马铃薯组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处

理时间，以减少组织的死亡。2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍马铃薯细胞对基质中营养物质的吸收。4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。5、HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。 2培养基

培养基是植物组织生长的物质基础，因此其组成和理化性质都非常重要。马铃薯组织培养通常使用MS 基本培养基，并根据植物的生长状态加入适当的激素和其他营养物质。离体条件下，植物激素对马铃薯茎段愈伤组织的诱导、分化起着重要作用。在有植物生长调节剂的培养基上愈伤组织诱导率可达100%，在不含激素的培养基上基本不形成愈伤组织。高浓度的生长素和细胞分裂素配比有利于愈伤组织的诱导，而低浓度配比则有利于愈伤组织的分化。马铃薯离体组织培养常用的激素有：生长素如2,4-D 、IAA 、NAA ，细胞分裂素如KT 、6-BA ，还有赤霉素。实验中应该根据研究目的选择合适的激素配比，各种激素均有其最适浓度，过高或过低都会影响植株成愈和分化。培养基的pH 值也有重要影响，pH 值影响培养基凝固程度和材料吸收营养。培养基渗透压50.7~202.7kPa适合于植物组织生长，太高会抑制其生长和分化。

3愈伤组织培养脱毒：通过植物器官和组织的培养，分化诱导产生愈伤组织，愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。原因是受感染植株的组织脱分化形成愈伤组织中，细胞不携带病毒或细胞不含病毒。其原因是：病毒的复制速度比细胞的增殖速度慢；有些细胞通过突变体获得了抗病毒的特性，抗病毒侵染的细胞甚至可能与敏感型细胞一起存在于母体组织中。 试验表明，愈伤组织培养脱除病毒的效果比茎尖培养成功率高，但愈伤组织培养所产生的植株遗传性状不稳定，在生产中要注意这个问题。

4环境因素 1光照

马铃薯不同外植体对光暗要求不同。黑暗有助于提高块茎和茎段出愈率，而光照可以增加茎尖、叶片出愈率和出愈速度。 2温度

温度对器官发生的数量和质量有影响。大多数植物在（25±2）℃生长良好。植物组织培养中，一般都采用22~25℃的恒温条件进行外植体培养。马铃薯组织培养过程均在这个温度范围内进行。 3湿度

环境湿度过大会引起霉菌污染，湿度过低虽然不会直接影响培养容器内的湿度，但当培养过久或温度过高时培养基会变干，改变培养基各组分的浓度，影响组织正常生长，应及时转接以保证试管苗水分和营养供应。马铃薯组织培养过程要求室内湿度恒定，相对湿度保持70%~80%为好。 4气体

培养容器内气体成分影响培养物的生长和分化。如果培养容器通透性太好，水分易散失；通透性太差，瓶中产生的有害气体不易扩散。当培养基中氧浓度低于临界水平时，利于形成胚状体；反之，则利于形成根。 常见问题与对策常见问题与对策 1污染

造成污染的原因很多，如工作环境空气不清洁，超净工作台过滤装置失效，培养基及器皿灭菌不彻底，外植体带菌及操作违规等。造成污染的病原主要为细菌、真菌、内源菌。其中细菌的污染主要靠上文提到的消毒灭菌方法消除，而真菌污染多是由接种内的空气不清洁等原因造成的，此类污染可通过完善操作、培养环境，严格操作程序来克服。在植物组织培养过程中，较难处理的是内源菌污染。内源菌污染是由于外植体材料内部（细胞内或细胞间）的微生物（如内生细菌、真菌等）不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料代入培养过程造成的。对策为①改进外植体消毒方法，如利用间隙消毒法。②反复检查培养物，因为有些污染很长时间才会表现，有些污染不经细致检查不易发现。

③使用抗生素。 2褐变

马铃薯组织培养过程中常常会出现褐变现象。褐变是由多方面的因素导致的，其根本原因是组织块含有酚类物质，酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素合成的前提。因此，当酚类化合物含量高的时候，在合适的pH 值、温度等条件下，酚氧化酶、酚类和氧气发生氧化反应，形成木质素、单宁和色素等有毒的醌类化合物，切口表面迅速变成褐色或棕色。添加防褐剂可使马铃薯外植体愈伤组织诱导分化褐变现象减弱，常用防褐剂有活性炭、维生素C 、柠檬酸、PVP 、硫代硫酸钠等。 3玻璃化

植物组织培养中，常可见到一些半透明状的畸形试管苗，这类植物体被称为“玻璃苗”，这种现象被称为“玻璃化现象”，又称过度水化现象。发生玻璃化的组织培养苗，其组织结构和生理功能异常，分化能力低下，难以增殖成芽和生根成苗，移栽大田更难成活。防治对策一般有以下几项：①利用固体培养，增加琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏。②适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势。③注意通气，降低培养容器内的相对空气湿度和改善氧气供应状况。④适当降低培养基中NH4+浓度，或者及时转移；适当提高培养基中的Ca2+浓度。⑤适当进行低温处理。⑥增加自然光照。

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