无公害豆芽:6-苄基腺嘌呤残留量和4-氯苯氧乙酸钠残留量的测定
前 言
DB33/ 625－2007《无公害豆芽》分为三个部分：
——第1部分：生产技术规程；
——第2部分：质量安全要求；
——第3部分：6-苄基腺嘌呤残留量和4-氯苯氧乙酸钠残留量的测定。
本部分为DB33/ 625－2007《无公害豆芽》第3部分。
本部分的附录A和附录B为资料性附录。
本部分起草单位：浙江省疾病预防控制中心、宁波市疾病预防控制中心、杭州市质量技术监督检测院、浙江省农业厅农作物管理局、宁波市卫生监督所、宁波市五龙潭蔬菜食品有限公司、宁波市质量技术监督局。
本部分主要起草人：李小平、韩见龙、蔡增轩、金米聪、赵建阳、芮昶、蒋经伟、陶礼明、戴建刚。
无公害豆芽：6－苄基腺嘌呤残留量和4－氯苯氧乙酸钠残留量的测定
第一法 豆芽中6-苄基腺嘌呤残留量的测定——LC-MS/MS法
1 范围
本方法规定了豆芽中6-苄基腺嘌呤的测定方法。
本方法适用于豆芽中6-苄基腺嘌呤的测定。
本方法检出限为1×10-6 mg/kg。
2 原理
豆芽中残留的6-苄基腺嘌呤经酸化甲醇提取，反相柱分离，电喷雾离子化（ESI）和多离子反应监测（MRM）方式进行定量测定。以试样峰的保留时间、母离子（m/z: 226.20[M+H]+）与子离子(226.20>91.0, 226.20>147.90)定性，以子离子(226.20>91.0)峰面积外标法定量。
3 试剂
除非另有规定，仅使用分析纯试剂、蒸馏水或去离子水。
3.1 乙酸。
3.2 乙腈（HPLC）。
3.3 甲醇（HPLC）。
3.4 50%的甲醇水溶液。
3.5 酸化甲醇：每100 mL甲醇中加入乙酸50μL，混匀。
3.6 标准溶液的配置：
3.6.1 标准储备溶液
精密称取6-苄基腺嘌呤（含量＞98.0％）0.1000g于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，作为标准储备溶液。此标准储备溶液每毫升相当于1.0 mg 6-苄基腺嘌呤。标准使用液用甲醇稀释至每毫升含1μg的6-苄基腺嘌呤。在4℃冰箱中储存，有效期1个月。
3.6.2 标准工作溶液
空白豆芽萃取液制备
选择在生产过程中未添加6-苄基腺嘌呤的豆芽菜。按5.1 试样处理方法提取，经0.22μm有机
滤膜过滤。必要时使用LC-MS/MS分析，以确定在6-苄基腺嘌呤出峰处不存在干扰。
标准工作溶液系列配制
准确吸取标注使用液1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL于进样瓶中，加空白豆芽萃取液（3.6.2.1）至1 mL。配制成浓度依次为1 ng/mL、2ng/mL、4 ng/mL、6 ng/mL、8 ng/mL、10 ng/mL的标准溶液系列，供LC-MS/MS分析。
4 仪器
4.1 组织捣碎机。
4.2 天平（精度0.01和0.0001g）。
4.3 高效液相色谱-电喷雾-串联四极杆质谱（LC-ESI-MS/MS）。
4.4 均质机（速度范围： 6,000－24,000 rpm）。
4.5 离心机(最高转速:15,000 RPM)。
5 分析步骤
5.1 试样处理
称取豆芽样品500g用食物粉碎机粉碎后，取5g样品（精确至0.01g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL酸化甲醇，用均质机匀质3 min,10000 rpm离心10min，上清液转入50 mL容量瓶中，样品再用10 mL酸化甲醇重复提取一次。合并上清液，用水定容至刻度，摇匀，吸取2mL于10容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，经0.2μm 滤膜过滤，供LC-MS/MS分析。
5.2 色谱参考条件
色谱柱：Waters SunFire C18柱（2.1mm×150mm， 5μm 颗径）。
流动相A：水（0.1%甲酸）。
流动相B：甲醇（0.1%甲酸）。
流速：0.30 mL/min。
进样量： 10 uL。
柱温：35℃。
表1 梯度洗脱条件
时间（min）
流动相A
流动相B
变化曲线
0.00
50%
50%
3.00
44%
56%
6
3.25
0%
0%
6
4.25
0%
0%
1
4.50
50%
50%
6
8.00
50%
50%
1
注：变化曲线：1为立即变化，6为线性变化
5.3 质谱参考条件
离子化方式 ESI+。
毛细管电压 (kV) 3.00。
锥孔电压 (V) 57。
RF Lens 1 35.0。
Aperture (V) 0.0。
RF Lens 2 0.3。
源温度 (℃) 120。
脱溶剂温度 (℃) 350。
锥孔反吹气流 (L/Hr) 50。
脱溶剂气流 (L/Hr) 454。
LM 1 Resolution 12.0。
HM 1 Resolution 12.0。
离子能量 1 0.5。
LM 2 Resolution 12.0。
HM 2 Resolution 12.0。
离子能量 2 1.0。
光电倍增管 (V) 650。
碰撞池气压(mbar) 3.03e-3。
5.4 测定
准确吸取10.0μL标准系列溶液和试样溶液注入液相色谱-质谱联用仪中，按照本标准5.2和5.3项条件进行检测，以保留时间及子离子226.20>91.0，>147.90进行定性，以子离子226.20>91.0的峰面积外标法定量。参见附录A。
5.5 结果计算
按外标法计算试样中6-苄基腺嘌呤的含量。
见下式：
式中：
X—试样中6-苄基腺嘌呤的含量，mg/kg；
A—试样中定量子离子面积对应的6-苄基腺嘌呤的质量，μg；
f—试样的稀释倍数；
m—试样的取样量，g。
计算结果表示到三位有效数字。
6 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果绝对差值不得超过算术平均值的20%。
来源:浙江农网