乳酸链球菌素Nisin检测技术的研究进展
乳酸链球菌素(Nisin)检测技术的研究进展
李良玉,王鹤霖
(黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319)
摘要:乳酸链球菌素(Nisin)是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。它广泛的应用于食品工业,但是它的检测技术还较落后,阻碍了其进一步的发展。本文研究了目前的一些检测技术,进行分析讨论,结果显示目前的方法都存在各自的缺陷,最后进行了展望。
关键字:乳酸链球菌素,检测技术,展望中图分类号:TS207.3
文献标识码:A
文章编号:1006—2513(2008)05-0149—04
Development
on
thedetectivetechnologyofNisin
Lang-yu,WANGHe-lin
LI
Abstract:Nisinis
a
worldrecognizedthenaturalbiologicalsafefoodpreservativeand
wagnot
antibacterial
agents.Itwidely
usedinthefoodindustry.butitsdetectiontechnologywelldeveloped.The
currentNisindetection
teehnologie8
and
theirdefectivesweresurnlnKrized.
Keyword:Nisin;detectiontechniques;prospect
1前言
乳链球菌肽,亦称乳酸链球菌素,是从乳酸
乳球菌或乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽
抗菌素类物质,是一种世界公认的安全的天然生
物性食品防腐剂和抗菌剂。Nisin在1928年由美国学者LA.Rogers和Whitter发现,20世纪50年
代初,由英国的阿普林和巴特雷公司
(Applin&BerreteLtd)商业化生产…。
Nisin是由34个氨基酸组成的多肽,其分子
图1Nisin的结构
Nisin分子为酸性,在酸性条件下稳定,pH低时
易溶解(57mg/mL,pH2.0),pH较高时溶解度
量为3510,属于羊毛硫抗生素(Lantibiotics),活
性部位含有大量的稀有氨基酸,包括羊毛硫氨酸、卢一甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、芦一甲基脱氢丙氨酸等一些非编码的氨基酸。Nisin的活性
大为降低(0.25mg/mL,pH8~12)。Nisin是对
热稳定的(1000C10min),在酸性条件下可以耐
受115。C高压蒸汽灭菌,大分子物质如牛奶肉汤培养基等可保护Nisin不易失活,因此加入食品
中的Nisin其活性在加热时可以得到保护旧J。
分子常以二聚体和四聚体的形式存在,其分子量分别为7,000和14,000【2J。
收稿日期:2008—06—03
作者简介:李良玉(1982一),男,硕士研究生,研究方向为畜产品加工。
2
Nisin的检测技术
20世纪40—60年代人们常用液体检测法,
例如:1934年,Cox采用甲基兰还原实验测定牛
乳中乳酸链球菌素及其产生菌的存在;1950年,Hirseh发展了延迟法,其基本原理依赖于甲基兰还原法;1952年,Bemdge提出了比浊法【4J。这些方法虽能快速得到结果,但由于其操作烦琐,条件不易控制,结果不够稳定,现在已很少使用。
最近根据nisin的性质,Nisin的检测方法大致可以分为三类:1、基于抑菌活性的检测方法;2、基于免疫学的检测方法;3、基于Nisin自诱
导作用的生物荧光法。
2.1基于抑菌活性的检测方法(琼脂扩散法测定Nisin效价)
1956年,Mocquot在培养基中引入吐温80,促进乳酸链球菌素在琼脂培养基中的扩散;1957年Cheralier推荐使用琼脂平板扩散法"J:1964年,Tamer怕1用l%的吐温20改进了Mocquot的方法,用于测定食品中乳酸链球菌素的活性。
琼脂平板扩散法的基本方法是:将效价检测培养基冷却至450C左右时,加入2%指示菌菌悬液,摇匀,准确吸取20ml该培养基加入水平放置的培养皿内,凝固后加入样液,静K0.5h移至
30℃培养粉内培养24h,然后测量抑菌圈直径。
测量抑菌圈直径后,以nisin标准液对数值为横坐标,抑菌罔直径为纵坐标,绘制标准曲线。标准
曲线斜率可反映nisin标准液浓度变化对应的抑菌
圈直径的变化,即测定的精确性,斜率越大扩散性越好,反之越差;标准曲线与Y轴截距可反映最低nisin效价,各处理抑菌圈直径的大小,即测
定的灵敏度。
1999年山东轻院吴琼[71用打孔法检测乳酸菌
素.通过对菌液浓度、吐温20添加、琼脂浓度、平板厚度等方面的研究得到最适条件为:在含指
示菌106/f"/mL的培养基中加入0.5%tween20,
0.75%琼脂以及琼脂层厚度为2mm时检测效果最佳,精确度为78%。
同年天津轻院何宁【81等人用杯碟法检测了乳
酸菌素.通过对检测平板培养基的pH,指示菌浓
度,指示菌不同生长期,检测平板中吐温浓度,检
测平板中次甲基兰浓度的研究,确定了检测乳酸
菌素的最佳条件:在含指示菌106似mL的培养
基中加入l%吐温80,0.002%次甲基兰,并将
pH调至5.0为其最佳检测条件,精确度为83%。
2007年郑州大学离子束生物工程实验室的张
国只、陈林海等【91对琼脂扩散法测定乳链菌肽效
价进行了优化。通过对不同浓度琼脂;不同浓度
Tween20;不同温度培养检测平板;不同的预培
养方案的研究。结果表明,0.75%琼脂的效价检测培养基、0.5%tween20的添加以及30℃培养条件,可提高乳链菌肽效价测定的灵敏度和精确性;4。C预培养有利于乳链菌肽在琼脂中的扩散9l%。
由上所述,我们可以看出这些方法都是基于
抑菌活性的检测方法(琼脂扩散法),只是研究
的影响因素不同。张国只、陈林海等的研究的精
确度较好,但是如果把这些因素都考虑进行多元旋转分析,可能会有更好的实验效果。
在20世纪70年代,以免疫学为基础的高特异性检测方法作为分析手段广泛地应用于各种研究领域,随着免疫学的发展,这种方法自然也应用于细菌素的检测,出现了各种快速、直接、灵
敏的检测方法,如夹心酶联免疫吸附法(sand—
ELISA)、竞争酶联免疫吸附法(competitivedi—munoblotassay),但是这些方法只是抗体应用的不同形式,其本质还是依赖于抗体技术的发展。
将抗体与固相载体联结,形成固相抗体,Ni—氧化物酶标抗原,样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,待测样品中抗原含量越高,则与固相抗体结合的越多,使得酶标抗原与固相抗1990年,Falahee【l驯发展了多克隆抗血清分2.2基于免疫学的检测方法
wich—typeenzymelinkedim,munosorbentassays,
rectandindirectELISA)、斑点免疫印迹法(dotim-sin可与多克隆抗体特异性结合,利用竞争酶联免
疫吸附法加入待测样品。Nisin和一定量的辣根过
体结合的机会就越少,甚至没有机会结合,这样
加入底物后,根据颜色的不同来分析nisin的含量。
析乳酸链球菌素的酶联免疫分析法(ELISA),该方法可测定样品中的乳酸链球菌素.1992Falahee
的酶联免疫吸附法对纯nisin及奶酪中nisin的最
低检测浓度分别是20ng/mL、200ng/mL。
1996年Suacrez,RodriguezLlⅥ设计的多克隆
抗体酶联免疫吸附法的最低检测浓度分别是5~
10ng/mL,牛奶和乳清中可检测到170ng/mL。
1999年Bouksaim¨21设计了单克隆抗体并用斑点免疫印迹法进行了实验,其结果为:对纯ni-
sin可检测到3ng/mL、牛奶和乳清中可检测到
155ne,/mL。
11t2
Nisin通过信号转导荧光素酶
表1各方法的比较
根据nisin的这种自诱导特性,Wahlsto&m等设计了质粒pPLE535,其中PnisF是nisF的启动子,luxHb是编码荧光素酶的基因,提出了一种
生物荧光检测法。
他们把质粒pPLE535转入不产nisin的乳酸乳球菌MGl614,它是生长在加入了氯霉素的
由上表我们可以看出Bouksaim的单克隆抗体M17GS培养基中,并且在600nto处吸光度达到是较好的,对纯nisin可检测到3ng/mL、牛奶和
0.5之前是不通风的。加入丙三醇(87%)容量
乳清中可检测到155ng/mL。
的五分之一,且细菌在用之前应被存放了在2.3基于Nisin自诱导作用的生物荧光法
一70℃。指示菌被稀释了100倍并在M17GS加上
1998年,Saris提出了一种更为新颖的生物发0.1%非离子活性剂土温80。Nisin标准样加入到光技术,它可以测定出牛奶食品中较低浓度的乳0.1%Tween80中,溶液用蒸馏水配置并用HCI调酸链球菌素【l
3|。
pH到2.5。5到70ul的nisin的稀释液被1mL的乳链菌肽的生物合成涉及11个基因,以ni-稀释指示菌,它是在300C下培养而且不通风。
sA/ZnisB,nisT,nisC、nM、nisP,nisR,nisK、.lmL细菌样加入40mL的癸醛3h,然后再加入nisFnisE和nisG的顺序成簇排列在乳链菌肽一蔗
1%的乙醇。最后立即用发光测量计1253确定萤
糖转座子左端约14kb的DNA片段上,其中nisA/
光素酶的活性。通过检测荧光素酶的表达量来检Z是编码乳链菌肽前体的结构基因,nisI、nisF、
测nisin的含量,这种方法的最低检测浓度可达到
nisE和nisG与菌体自身免疫有关,nisB、nisT、
0.0125ng/mL。
nisC和nisP是与乳链菌肽成熟有关的基因,而终上所述,琼脂扩散法是现在最为广泛的用nisR和nisK是双组分调节基因,位于nisFEG基
于检测nisin的方法,但是人们又普遍地认为它的因之前,它们分别编码组氨酸激酶和应答调节
影响因素太多,操作繁琐,而且准确性、重复性物,构成乳链菌肽生物合成的双组分调节系统,
也不是很理想,免疫学方法具有高灵敏性,但是
乳链菌肽生物合成基因簇的转录受3个启动子控却并不具有高特异性,而且现阶段抗体制备困制,分别表达nisABTCIP、nisRK和nisFEG这3难、成本高,这些都限制了它的应用,不过随着
个多顺反子转录物,PnisRK的表达是组成型的,抗体工程的发展,生产实用、廉价的检测试剂盒成熟的nisin在亚抑制浓度下可作为诱导物,通过
也不失为一个好的发展方向,基于nisin自诱导作NisRK双组分调节系统调节PnisA和PnisFEG的
用的检测方法设计得很精巧,只是基因的表达并转录,诱导作用与诱导物浓度呈正线性关系,克
不仅仅是受诱导物的调控,那么其检测结果不一
隆在这两个启动子下游的报告基因的转录也会呈定能够反映nisin的实际含量。
现线性剂量效应。
[4]TrainerJ.Microbiallnhibitom
in
Foods,(Molin,NEd.)Atmqvist
3展望
现有的nisin检测方法很多,但是都有各自的缺点。为了适应研究和生产的迫切需要,nisin的
快速检方法研究很有必要。在过去20年中,人们
andWiksell.Stockholm.1969:25
[5]胡国平,叶嗣颖.乳链菌肽(Nisin)的研究进展[J].中国微生
态学杂志.2001,13(2):115一117[6]TrainerJ,FowlerJJ.Estimationof
1964,15:5—22
nisinin
food[J].Food
Asric,
也应用了许多其它的新方法来检测nisin的含量,
如辐射线法、电导率测定法、自动化浊度法,基质辅助激光解吸/离子化质谱法、毛细管区带电
[7]吴琼.乳链菌肽效价测定方法的研究[J】.食品科学,
1999,20(6):56—59
[8]何宁,王昌禄.杯碟法检测乳酸菌素活性优化条件的研究
[J].天津轻工业学院学报.1999,(2):17—20
泳法、血细胞计数法等。但是这些方法并没有被广泛的接受,其原因主要是因为需要专用的仪器和设备,因此今后应大力发展相关的学科,继续加强Nisin现代检测技术方法的研究,提高分析的速度、灵敏度、精度和抗干扰性能。
’参考文献:[1]Mattick
ATR.Apowerfulinhibitorysubstanceproducedby
group
[9]张国只,陈林海,杨天佑,等,琼脂扩散法测定乳链菌肽效
价的优化[J].食品科学,2007,(3):175—177
[10]Falahee
M
B。Adams
from
M
R。DaleJW,eta1.Cross—reactivity0f
bacteriocins
otmsay
lacticacidbacteriaandlantibiotics
inanisinbi-
and
A
ELISA[J].JFoodSoiTechnol,1992,25:590M,RedrycguezJM,Hernacndez
P
[11]Suacrez
of
E,etat.Generation
strateg/es
pelyclonalantibedies马鲥nst
nisin:immunization
and
immunoassay
N
62:2117
development[J].ApplEnvironMicmbiol,1996,
streptococci.Natu—re,1994,154:551
[12]BouksaimM。Flissl,MeshroU¥.1mmunodotdetectionof
milk
nisinZin
[2]Gowii/i¥JL.Someproperties
of
Nisin.Brit“J].phatmacol,1952,
and
wheyusing
enhanced
chemiluminesc[J].ApplMicrnhi—
(7):438-445
[3]“uW,HansonJN.Somechemicalandphysical
sin,a
properties
ol,1999,84(2):176—84
of
ni—
[13]GWAHLSTROM,P,EJ.SARIS.ANisinBioasaayBased
oluminescenee[J].Applied1999,65(8):3742—3745
and
on
Bi・
small—proteinantibiotic
Environ
produced
byLmtoc∞∞slactis
environmentalmicrobiology,
[J].ApplMicrobiol,1990,56(8):2551—2558
(上接第145页)
态和乳清析出问题。牛乳、大豆分离蛋白在5:0.6~4:0.5左右的发酵酸奶在总体上接近于
纯牛奶发酵的酸奶。
2.6改善发酵酸奶风味的初步研究
表6添加柠檬酸对风昧改善的研究
柠檬酸(%)酸度(oT)
发酵酸奶性能
3结论和展望
牛乳、大豆分离蛋白在5:0.8~4:0.6左右(其中大豆分离蛋白必须经过酶解lh),添加复合稳定剂和0.15%柠檬酸的溶液,经发酵可制得风味口感较好后,双蛋白发酵乳,营养均衡,具有市场潜力和竞争力。
参考文献:
[1]赵新淮,冯志彪.蛋白质水解度的测定[J].食品科学
1994,(8):65—6
[2]食品分析[M].北京:中国轻工业出版社,2006:22—235
[3]张数权.酶制剂工业[M].北京:科学出版社。1984:456
添加柠檬酸可生成传统酸奶中香味成分乙醛
—46l
和二乙酰,并适当改善甜度,其中添加0.15%比
较合适。
[4]姜锡瑞.酶制剂应用手册[M].北京:中国轻工业出版社。
1999:263—283
乳酸链球菌素(Nisin)检测技术的研究进展
作者:作者单位:刊名:英文刊名:年,卷(期):被引用次数:
李良玉, 王鹤霖, LI Lang-yu, WANG He-lin黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆,163319中国食品添加剂
CHINA FOOD ADDITIVES2008,""(5)0次
参考文献(13条)
1.Mattick ATR Apowerful inhibitory substance produced by group N streptococci 19942.Gowans J L Some properties of Nisin.Brit 1952(07)
3.Liu W.Hansen J N Some chemical and physical properties of nisin,a small-protein antibioticproduced by Lactococcus lactis 1990(08)
4.Trainer J Microbial Inhibitors in Foods,(Molin,NEd.)Almqvist and Wiksell 19695.胡国平.叶嗣颖 乳链菌肽(Nisin)的研究进展[期刊论文]-中国微生态学杂志 2001(02)6.Tramer J.Fowler J J Estimation of nisin in food 19647.吴琼 乳链菌肽效价测定方法的研究 1999(06)
8.何宁.王昌禄 杯碟法检测乳酸菌素活性优化条件的研究[期刊论文]-天津轻工业学院学报 1999(02)9.张国只.陈林海.杨天佑 琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的优化[期刊论文]-食品科学 2007(03)
10.Falahee M B.Adams M R.Dale J W Cross-reactivity of bacteriocins from lactic acid bacteria andlantibiotics in a nisin bioassay and ELISA 1992
11.Suacrez A M.Rodrycguez J M.Hernacndez P E Generation of polyclonalantibodies againstnisin:immunization strategies and immunoassay development 1996
12.Bouksaim M.FlissI.Meghrous Immunodot detection of nisin Z in milk and whey using enhancedchemiluminesc 1999(02)
13.G WAHLSTROM.P,E J.SARIS A Nisin Bioassay Based on Bioluminescence 1999(08)
本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgsptjj200805026.aspx
授权使用:上海交通大学(shjtdxip),授权号:d15341b3-100a-48a4-9f26-9e1401216f8a
下载时间:2010年10月19日