各种感受态细胞
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本节讨论内容
2011年6月
质粒DNA转化感受态大肠杆菌
1 何彰华 赢润生物技术 2 3 4 2011年7月24日
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转化的概念及原理 常用的感受态菌株 感受态细胞的制备及转化 转化中的影响因素
1. 转化的概念及原理
2011年7月
感受态细胞
2011年7月
概念：在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或 以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获 得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之 一。 原理：受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法， CaCl2等化学试剂法）处理后，细胞膜的通透性发生 变化，能容许外源DNA分子通过。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）细 胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种 生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定 的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
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质粒DNA热击转化感受态大肠杆菌示意图
质粒DNA热击转化感受态大肠杆菌示意图
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0℃
CaCl2低渗
冰浴 热击
2-3分钟
42℃90s
质粒DNA
冰浴
感受态
羟基-磷酸钙复合物
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2. 常用的感受态菌株
2011年7月
2. 常用的感受态菌株
2011年7月
1）DH5a菌株 常用于质粒克隆，可用于蓝白斑筛选。 2）BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启 动子的表达载体（如pET系列）的基因。该菌适合 表达非毒性蛋白。 3）BL21(DE3) pLys菌株 PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低 目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的 表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
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4）JM109菌株 适合重组体菌株鉴别。 5）TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增， 能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 6）HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各 种基因重组实验。 7）JM110或 SCS110 可排除dam，dcm甲基化的影响。
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3. 感受态细胞的制备及转化
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3.1 实验材料与仪器准备
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3.1 实验材料与仪器准备 ； 3.2 CaCl2法制备感受态细胞及热击转化； 3.3 电转感受态细胞的制备及电击转化； 3.4 化学法与物理法的比较。
E. coli DH5α菌；LB液体培养基； LB固体培养基；100 mmol/L CaCl2溶液。
高速冷冻离心机
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恒温摇床
制冰机
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3.2 CaCl2法制备感受态细胞及热击转化
1）从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落， 接种于2.5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养 12h 左右。
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2）将培养好的菌悬液以 1: 100-1: 50 的比例接种于 100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养 2-3h 至 OD600为0.4左右。
取1 mL 菌液加入到 100mL 新鲜的LB液 体培养基中。
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3）将100mL菌液转移至两个50mL离心管内，4℃、 4500g离心5分钟，收集菌体。
4）加入30mL，100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重 悬细胞，冰浴30分钟。
冰浴30分钟
加入30mL冰冷的 100mM CaCl2，重 悬细胞
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5）4℃、4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml 100mM 的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即 成感受态细胞悬液。
6）感受态细胞分装成200μl的小份，暂且不用的贮 存于-70℃可保存半年，取其中一份进行转化。
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7）向转化管中加入质粒DNA（不超过10ul），轻 度摇晃混合后于冰上放置30分钟。
8）将上述混合物转移到42℃的水浴锅中，热击90 秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴， 冷却1-2分钟。
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9）向管内加入800ul的无抗LB培养液，37 ℃培养 45分钟。
10）取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的 LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温 放置几分钟。
37 ℃培养45分钟
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3.3 电转感受态细胞的制备及电转化
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11）倒置平板于37 ℃培养12-16个小时，观察菌斑 并鉴定。
1）从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌 落，接种于2.5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培 养 12h 左右。 2）将培养好的菌悬液以 1: 100 -1: 50 的比例接种于 100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养 3-6h 至 OD600为0.5-0.6。 3）将菌液在冰水浴中冷却15分钟，再转移至两个预 冷的50mL离心管中，4 ℃、4500g离心15分钟，收集 菌体。
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4）小心弃去上清液，用50mL灭菌的冰水重悬菌 体，4℃、4500g离心15分钟，收集菌体； 5）照上面步骤重复2次，小心弃去上清液 ； 6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml ； 7） 将细胞按100μl等份装入微量离心管，于-80℃ 保存。
8）将 1-10μl DNA加入电转感受态细胞中，冰上培 育约5分钟 ； 9）转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容 器中，排除气泡； 10）加载P1000，准备好300μl 无抗LB ； 11）对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆，25μFd， 2.5 千伏）；
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电转感受态细胞的制备及电转化示意图
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12）立即添加300μl 的LB至电穿孔容器中，轻轻 混匀后转移至干净的EP管中； 13）37 ℃下孵育40-60分钟，使细胞恢复生长； 14）转移细胞至适当的选择培养基上培养。
扩大培养 至对数期
培养菌种
抗性平板筛 选阳性克隆
温育1h
电击
冰浴15分钟 离心 漂洗离心 重悬分装 感受态 DNA
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3.4 两种方法的比较
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电击法: 使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬 液，微生物细胞膜在高压电的作用下发生去极化， 产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的 孔洞进入细胞内部。 化学法：使用低渗溶液处理细胞悬液（0.1M CaCl2），微生物细胞膜结构会发生一些变化，使 得细胞在热激时（42℃，90s）变得很容易从溶液 中摄取DNA。
做电击转化时，悬液中有近70%的细胞会因电击而死 亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。当需要高 的转化效率时，比如制作基因文库，可以采用电击转 化，另外，做酵母等真核生物转化时一般都是电击。 化学转化法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足 以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。
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两种方法的比较
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4.感受态细胞制备及转化中的影响因素
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方法
转化条件
仪器要求 电转仪 电转杯
感受态 效率、应用 电转感 受态 108 基因文库 107 一般克隆
⑴ 细胞的生长状态和密度 A. 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接 用于制备感受态细胞的菌液。 B. 细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在 5×107个左右为佳。 C. 受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株， 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
电击法 2.5 千伏电击
化学法 CaCl2
42℃热击
恒温水浴 CaCl2感 受态
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⑵ 质粒DNA的质量和浓度 A. 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率 与外源DNA的浓度在一定范围内成正比； B. 对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转 化效率低； C. 重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状 重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100倍。
⑶ 试剂的质量 所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯 净的水配制，最好分装保存于4℃。 ⑷ 防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿， 如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处 理。 ⑸ 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细 胞转化率将会降低。
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2011年7月
谢谢大家！
热击转化实验回顾
37 ℃培养45分钟
祝：身体健康，
学习愉快！
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