离子源与质谱仪作用机理
质谱离子源及质量分析器的种类及作
用机理
课程名称 掺伪掺杂食品鉴别与检验技术
学 院专 业姓 名学 号指导老师
二〇一四年七月
质谱离子源及质量分析器的种类及作用机理
质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，可用来分析同位素成分、有机物构造及元素成分等。其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。与色谱分析技术同为现代掺伪掺杂技术的支撑，色谱是一种分离的手段，而质谱是一种鉴定手段，检验过程中通常采用质谱联用技术。质谱仪器一般由样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理系统等部分组成。
质谱分析作为一种新型的现代仪器分析手段，因其高灵敏性、高准确性、高选择性、分析检测范围宽以及其定性、定量方面的强大功能等特点，在食品添加剂、激素、抗生素，农兽药残留等食品分析检测领域得到了广泛的应用。下面主要介绍几种主要：质谱离子源及质量分析器的种类及作用机理。
1 离子源类型——“接口”技术
离子源是使中性原子或分子电离，并从中引出离子束流的装置。它是各种类型的质谱仪不可缺少的部件。离子源的性能决定了离子化效率，很大程度上决定了质谱仪的灵敏度。常见的离子化方式有两种：一种是样品在离子源中以气体的形式被离子化，另一种为从固体表面或溶液中溅射出带电离子。在很多情况下进样和离子化同时进行。常用的离子源有以下几种。
1.1快原子轰击源(Fast Atomic bombardment，FAB)
FAB是一种常用的离子源，由Barber研究小组于1981年研发成功并使用，适合于分析离子化能力强，极性强，分子量大、难气化、热稳定性差的样品，例如肽类、低聚糖、天然抗生素、有机金属络合物等，但对非极性样品灵敏度下降、低质量区以下产生较多干扰峰。FAB得到的质谱不仅有较强的准分子离子峰，而且有较丰富的结构信息。但是，它的分子量信息不是分子离子峰M，而往往是(M+H)+或(M+Na)+等准分子离子峰。FAB主要用于磁式双聚焦质谱仪。
1.2电喷雾电离源(Electrospray ionization，ESI)
样品溶液经色谱柱分离，流经色谱管，到达喷雾针，针上加有3~5kV的电压，在强电场和雾化气的作用下，溶液迅速雾化产生高电荷液滴，并形成扇状喷雾。在加热辅助气及高温条件下，溶剂迅速蒸发，带电液滴的表面积不断缩小，表面电荷密度逐渐增大。当密度达到“Rayleigh极限”时，带电雾滴中的样品就会由于雾滴发生“库伦爆裂”而分离出来，形成样品离子。带电的碎片离子就在电场的作用下进入质谱的质量分析器进行分析。ESI是一种软电离方式，常用来分析对热不稳定的极性化合物。
1.3大气压化学电离源(Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI)
APCI源是在大气压下利用电晕放电来使气相样品与流动相电离的一种离子化技术。经色谱柱分离的样品溶液随流动相一起到达源内的石英管，经加热并在雾化气和辅助加热气的共同作用下，溶液气化。位于石英加热管和Orifice之间的带有冠状尖端的放电电极使雾化气或者空气电离，产生初级离子N2+、O2+，初级离子迅速与气化的溶剂分子反应，生成反应离子，反应离子以质子转移的方式使待测样品分子带电，并在电场的作用下进入质谱的真空系统。以上为APCI源的三步电离过程。
APCI源适用于非极性或低、中等极性且对热稳定的化合物，能适应0.2~2Ml/min的宽流量变化范围。由于极少形成多电荷离子，分析的分子量范围
1.4大气压光电离源(Atmospheric Pressure Photo Ionization，APPI)
APPI源与APCI源的电离机制基本相似，只是用紫外灯取代APCI源的电晕放电，是利用光化学作用将气相中的样品电离的离子化技术。APPI源适用于分析非极性化合物。大气压电喷雾源(ESI)，大气压化学电离源(APCI)和大气压光电离源(APPI)是大气压电离源(API)的3种不同形式，由于大气压电离源独立于高真空状态的质量分析器之外，故不同大气压电离源之间可随意切换。
1.5基质辅助激光解析电离源(Matrix assisted Laser Desorption
Ionization，MALDI)
将溶于适当基质中的样品涂布于金属靶上，用高强度的紫外或红外脉冲激光照射可实现样品的离子化。此方式主要用于可达100000Da质量的大分子分析，且仅限于作为飞行时间质量分析器的离子源使用。
2 质谱质量分析器的种类
质量分析器是质谱仪的核心，是确保仪器具有高灵敏性、高准确性、高选择性、分析检测范围宽等强大功能的重要部分。经色谱分离、离子源离子化的大量离子进入高真空的质谱体系，并进行一级碎裂、二级碎裂甚至多级碎裂，实现MS1、MS2以至MSn。的功能，从而使质谱能够分析质荷比从几个到几万个道尔顿不等的质量碎片，更好地满足了科研及残留检测的需要。
质量分析器将带电离子根据其质荷比加以分离，用于纪录各种离子的质量数和丰度。质量分析器的两个主要技术参数是所能测定的质荷比(质量数)的范围和分辨率。依据设计原理的不同，分为以下几种。
2.1扇形磁场分析器
离子源中生成的离子通过扇形磁场和狭缝聚焦形成离子束。离子离开离子源后，进入垂直于其前进方向的磁场。不同质荷比的离子在磁场的作用下，前进方向产生不同的偏转，从而使离子束发散。由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有特有的运动曲率半径，通过改变磁场强度，检测依次通过狭缝出口的离子，而实现离子的空间分离，形成质谱。扇形磁场分析器具有重现性好、分辨率与质量大小无关、能够较快地进行扫描（每秒 10 个质荷比单位）等优点。但在目前出现的小型化质量分析器中，扇形磁场所占的比重不大，因为如果把磁场体积和重量降低将极大地影响磁场的强度，从而大大削弱其分析性能。但是，随着新材料和新技术的不断出现，这种局面可望在将来得到改观。
2.2四极杆分析器
因其由4根严格平行的棒状电极组成而得名。离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流固定电压(DC)和一个射频电压(RF)作用在棒状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。将DC和RF以固定的斜率变化，
可以实现质谱扫描功能。四极杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度，且能够通过电场的调节进行质量扫描或质量选择，质量分析器的尺寸能够做到很小，扫描速度快，无论是操作还是机械构造，均相对简单。但这种仪器的分辨率不高；杆体易被污染；维护和装调难度较大。
2.3离子阱分析器
由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压(RF)，通过施加适当电压就可以形成一个势能阱(离子阱)。根据RF电压的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的RF电压，离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱，被电子倍增监测器检测。目前离子阱分析器已发展到可以分析质荷比高达数千的离子。离子阱有全扫描和选择离子扫描功能，同时利用离子储存技术，可以选择任一质量离子进行碰撞解离，实现二级或多级MSn分析功能。但离子阱的全扫描和选择离子扫描的灵敏度是相似的。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度，而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实现多级质谱(MSn)的功能。广泛应用于蛋白质组学和药物代谢分析。
离子阱内部的离子总是在做复杂的运动，在这种复杂运动中，包含了与质量相关的特征信息。以这种特征信息为基础，发展了许多离子阱操作的新模式，大大拓宽了离子阱质量分析器的质量范围，改善了质量分辨率。虽然离子阱内离子的运动是复杂的，但就离子阱质量分析器本身而言，它具有许多独特的优点，主要是能够方便地进行级联质谱测量，能够承受较高压力（如 0.1 Pa），此外，这种质量分析器价格相对低廉，体积较小，被广泛用做色谱检测器。在质谱仪器的小型化中，离子阱的小型化取得了十分注目的成果。普度（Purdue）大学 Cooks 教授研究组的工作显得尤为突出，发展出来的圆柱型离子阱和矩形离子阱等不但克服了离子阱难以加工的缺点，而且进一步降低了成本、简化了操作，显著减轻了重量，缩小了体积，甚至可做成质量传感器（mass sensor），有望在现场环境监测、国防、刑侦、安检、工业过程控制等领域发挥作用。
2.4飞行时间分析器（TOF）
具有相同动能、不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子由于飞行时间短而首
可以实现质谱扫描功能。四极杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度，且能够通过电场的调节进行质量扫描或质量选择，质量分析器的尺寸能够做到很小，扫描速度快，无论是操作还是机械构造，均相对简单。但这种仪器的分辨率不高；杆体易被污染；维护和装调难度较大。
2.3离子阱分析器
由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压(RF)，通过施加适当电压就可以形成一个势能阱(离子阱)。根据RF电压的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的RF电压，离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱，被电子倍增监测器检测。目前离子阱分析器已发展到可以分析质荷比高达数千的离子。离子阱有全扫描和选择离子扫描功能，同时利用离子储存技术，可以选择任一质量离子进行碰撞解离，实现二级或多级MSn分析功能。但离子阱的全扫描和选择离子扫描的灵敏度是相似的。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度，而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实现多级质谱(MSn)的功能。广泛应用于蛋白质组学和药物代谢分析。
离子阱内部的离子总是在做复杂的运动，在这种复杂运动中，包含了与质量相关的特征信息。以这种特征信息为基础，发展了许多离子阱操作的新模式，大大拓宽了离子阱质量分析器的质量范围，改善了质量分辨率。虽然离子阱内离子的运动是复杂的，但就离子阱质量分析器本身而言，它具有许多独特的优点，主要是能够方便地进行级联质谱测量，能够承受较高压力（如 0.1 Pa），此外，这种质量分析器价格相对低廉，体积较小，被广泛用做色谱检测器。在质谱仪器的小型化中，离子阱的小型化取得了十分注目的成果。普度（Purdue）大学 Cooks 教授研究组的工作显得尤为突出，发展出来的圆柱型离子阱和矩形离子阱等不但克服了离子阱难以加工的缺点，而且进一步降低了成本、简化了操作，显著减轻了重量，缩小了体积，甚至可做成质量传感器（mass sensor），有望在现场环境监测、国防、刑侦、安检、工业过程控制等领域发挥作用。
2.4飞行时间分析器（TOF）
具有相同动能、不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子由于飞行时间短而首
先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。离子以离散包的形式引入质谱仪，这样可以统一飞行的起点，依次测量飞行的时间。离子包通过一个脉冲或者一个栅系统连续产生，但只在一个特定的时间引入飞行管。飞行时间质量分析器（TOF）具有结构简单、灵敏度高和质量范围宽等优点（因为大分子离子的速度慢，更易于测量），尤其是与 MALDI 技术联用时更是如此。TOF理论上不存在质量上限，新发展的飞行时间分析器具有大的质量分析范围和较高的质量分辨率，尤其适合蛋白等生物大分子分析，目前主要应用在生物质谱领域。
2.5傅里叶变换分析器
又称傅里叶离子回旋共振质量分析器。其原理为在一定强度的磁场中，离子做圆周运动，离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和回旋频率相同时，离子稳定加速，运动轨道半径越来越大，动能也越来越大。当电场消失时，沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流。对信号频率进行分析可得出离子质量，将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。其优点为分辨率很高，质荷比可以精确到0.1%道尔顿。
3 质谱仪的应用
3.1质谱法对蛋白质组学的定性研究
3.1.1 肽质量指纹法
基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测量法，以多肽质量/电荷比为依据同数据库资料进行比较，进而对蛋白质进行鉴定，此法通常被称为肽质量指纹法。肽质量指纹法是在测定前进行透析，有效去除了盐分，可得到满意的样品峰。依靠可靠的数据库检索，仅用少量的肽片段即可鉴定蛋白质。基质辅助激光解吸电离能够耐受少量杂质的存在，对于纯度不是很高的样品也能得到理想的结果。因此，肽质量指纹法被认为是鉴定蛋白质最常用、最快速、最有效的方法。肽质量指纹法的关键是相对分子质量的精确度，但蛋白质翻译的多种可能性易导致错误鉴定，所以该法通常只能适用于已完成测序、数据库注释详尽的小基因组的生物。但随着搜索数据库算法的增强，肽质量指纹法得到进一步的发展，可以快速选择候选评分复杂蛋白质，使鉴定精度大为提高。
2.1.2 色谱与质谱连用
将色谱技术与新型质谱技术相结合，可有效地克服双向凝胶电泳/质谱的不足，确保了分析的准确性。色谱和质谱连用鉴定蛋白质组技术是由Yates的实验室首先介绍的，先对蛋白质混合物进行酶切得到混合肽段，然后通过强离子交换反相色谱柱进行多次分离，并连用液相色谱-串联质谱分析肽段，而且通过核素标记肽段的技术实现蛋白定量分析。分离后的产品离子得到完好地扫描，连用分析肽段，可以区分待测蛋白质和其他类似物。色谱、质谱连用技术发展迅速，但是由于蛋白质不易完全分离，导致质谱峰重叠，降低了鉴定的准确性。另外，由于蛋白质翻译后修饰，源于相同基因的蛋白质可能迁移至不同位置，也会对鉴定造成困难。一些新的联用方式，如反相色谱与二维凝胶电泳与质谱的联用，强阳离子交换色谱与质谱的联用，以及高效液相色谱与傅立叶变换质量分析器的联用，使情况大为改观。
2.1.3 串联质谱技术
蛋白质串联质谱鉴定是利用了肽段氨基酸序列的特异性，其鉴定蛋白质的特异性更高，仅一条肽段就可鉴定蛋白质，可用于蛋白质混和物的鉴定。适当调整后，可鉴定蛋白质翻译后修饰，它是目前鉴定蛋白质常用的方法。大致分为空间串联质谱和时间串联质谱。离子阱质量分析器耦合时间串联质谱，可在同一个质量分析器上完成母离子选择、存储、分裂和检测工作。单一运用空间串联质谱完成同类工作需要几个分析器。相对地，离子阱质量分析器耦合时间串联质谱，可有效地去除其他碎片离子的干扰，适应在复杂背景下分析，具有高离子通量和高效的优点。串联质谱技术要求样品纯化，难于自动化，费时，仪器昂贵，难以操作和维护，所以未能普及至常规实验室。将色谱与串联质谱连用是近年来研究蛋白质组的新方法。
2.2 质谱法对蛋白质组学的定量研究
2.2.1 内源标定与液相色谱-串联质谱技术结合
内源标定技术分为稳定核素标记法和核素编码亲和标签法。稳定核素标记法与液相色谱2串联质谱连用量化准确性较高，回收率高，检测线低。选用特别标记的肽为内标，克服分离后的错误信息。一般用化学方法、酶切法或代谢法引入肽或蛋白质。在分析前，标记含有氨基酸的特定功能体，减少样品复杂性。如需要进一步降低复杂样品，可在质谱分析前用多维解离。稳定核素标记法也可在细
胞培养过程中进行。从培养的细胞库中提取其中蛋白质，分离后对凝胶上蛋白斑点酶切，利用每个多肽一对核素离子的强度测定相对丰度。核素编码亲和标签方法以特定半胱氨酸为基础，在蛋白质组中的蛋白质样品上标记核素生物亲和力标签。标记的蛋白质经酶切产生肽。这种方法通过富集半胱氨酸，降低了肽混合物的复杂性。但在分离过程中，大量不含有半胱氨酸的肽也会被分离，导致串联质谱图谱中未知蛋白质核质比等定性、定量因素改变。因此，核素编码亲和标签法仅能准确定量测量已知蛋白质，对未知物的定量是不准确的。
2.2.2 定量半胱氨酸浓缩技术( quantitative cysteinylpep tide enrichment technology， QCET)
这是一种新的定量技术，利用高通量定量蛋白质组稳定核素标记技术结合高分辨率的液相色谱2质谱，具有更高的效率和较大动态范围。其主要步骤顺序: ①从两个细胞中准备蛋白质样品，分别在胰酶消化的相同条件下，肽的每个样品通过固定2胰蛋白酶催化氧气交换，由分别160或180标记。②有特定标记的两个肽样品，有选择性地结合半胱氨酸。通过精细的洗涤，半胱氨酸从树脂中释放。③富集的胱氨酸用标签方法分析鉴定，并量化。这种方法涉及核素标记肽、高效浓缩含半胱氨酸肽、蛋白质大规模鉴定和准确定量以及使用时间标签。这项技术的优点包括以下几个方面：①用简单、高效的方法富集胱肽；②高通量蛋白质组分析法适应广泛；③提高工作效率，更好地标记定量测量。这项技术提高了系统的功能分析和检测临床生物的潜力。