奶水牛子宫内膜炎细菌的分离鉴定及药敏试验分析
··38
中国奶牛·2010年第6期
奶水牛子宫内膜炎细菌的分离鉴定及药敏试验分析
高玉梅1，何宝祥1，覃广胜2，杨宪苓1，郑威2
（1. 广西大学动物科学技术学院，南宁中图分类号：S 858.23
文献标识码：A
530004；2. 广西水牛研究所，南宁530004）
文章编号：1004－4264（2010）06－0038－03
摘要：本试验通过对南宁市周边奶水牛场的105头子宫内膜炎患牛进行调查、采样，并用常规方法对细菌进行分离、鉴定及药敏分析。共分离到细菌200株，其中分离率较高的是肠杆菌科细菌（87株/43.5%）、弧菌科细菌（46株/
23%）、非发酵细菌（35株/17.5%），另外还分离到葡萄球菌、链球菌和真菌32株，占分离菌株的16%，并且多数呈混
合感染。药敏试验分析结果显示，大多数致病菌对恩诺沙星、庆大霉素具有较高敏感性，而对青霉素和氨苄青霉素产生了强耐药性，对氨基糖苷类药物链霉素和卡那霉素也产生了不同程度的耐药性。关键词：子宫内膜炎；致病菌；药敏试验；奶水牛
奶牛子宫内膜炎是奶牛产后由病原菌感染引起的一种常见产科疾病。该病不仅影响其正常的生理功能, 而且会造成患牛长期不孕, 甚至造成终生不育而提前淘汰，给奶牛养殖业造成严重的经济损失。近年来, 国内外学者致力于对患子宫内膜炎奶牛子宫内菌群的分离鉴定研究，多数认为该疾病是由细菌、真菌、支原体及病毒等病原微生物感染引起的, 其中细菌性感染是子宫内膜炎的主要原因之一，而金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌等是子宫内膜炎的主要病原菌。但不同地区奶牛子宫内膜炎病原菌分离结果有所不同，有关引起南宁地区奶水牛子宫内膜炎的病原菌尚未见报道，给该地区临床防治奶水牛子宫内膜炎造成很大难度。为此，笔者对南宁地区奶水牛子宫内膜炎主要病原菌进行了分离、鉴定及药敏试验，以了解该地区引起奶水牛子宫炎的病原菌的情况，为奶水牛子宫内膜炎的防治提供参考依据。
属细菌生化常规鉴定管、非发酵细菌生化常规鉴定管、弧菌科细菌生化常规鉴定管、酵母真菌属生化常规鉴定管及其他细菌生化常规鉴定管和配套试剂、氧化酶纸片等，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.3病样的采集
选取经临床检查确诊为子宫内膜炎的奶水牛，清洗
消毒阴户，并取一支一次性输精管，用75％的酒精棉球擦拭消毒后，采用直肠把握法将其插入奶水牛子宫内，在输精管的另一侧，直接接上注射器，并向子宫内抽吸数次，将少量的子宫分泌物吸入到输精管内，取出输精管后，用75％的酒精棉球擦掉输精管外的粘附物，并将含有子宫分泌物的这段输精管剪下，放入已消毒的无菌试管中，密封待用。整个过程尽量保持无菌操作，避免污染，并做到一牛一管并纪录编号。
1.4病原菌分离、培养、鉴定
11.1
材料与方法供试动物
南宁地区不同奶牛场105头患有子宫内膜炎的奶
①将子宫分泌物接种于绵羊鲜血或牛鲜血平皿上，
培养时间18~24h；②对长出细菌的平皿进行优势菌落
的挑选并进一步做分离纯化培养，对难以纯化的菌先接种于马丁肉汤中，剧烈摇动20min 后再接种于平皿中进行培养，以便分离到单个菌落；③对纯化好的细菌进行革兰氏染色同时借助于抗酸染色、菌落形态及菌体大小对细菌进行初步分类，分别接种于改良爱德华琼脂平皿、却甫曼琼脂平皿、麦康凯琼脂平皿等鉴别培养基中；
水牛。
1.2试验试剂
普通营养琼脂培养基、马丁肉汤液体培养基、大豆
酪蛋白液体培养基、沙氏培养基、改良爱德华琼脂培养基、却甫曼琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基由本实验室按标准配制。肠杆菌科细菌生化常规鉴定管、葡萄球菌收稿日期：2010－01－26
作者简介：高玉梅（1986-），女，山东菏泽人，硕士生，主要从事动物临床
疾病分子生物学研究。
通讯作者：郑威。
④在此基础上进行接触酶、氧化酶、OF 等生化试验，对
发酵型细菌、非发酵型细菌以及各科之间的细菌进行分类。然后根据细菌的形态、染色特点及以上分类，用生化鉴定编码管鉴定，最后按照各科/属细菌/真菌生化鉴定编码册查出鉴定结果。
1.5药物敏感试验
中国奶牛·2010年第6期
··39
药敏纸片和MH 琼脂培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司。质控菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853，购自中国兽医药品监察所。根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS ）2000年版的药敏试验药物选择规则及临床要求，抗菌药片的选择为：恩诺沙星（恩）、头孢呋辛（呋）、新霉素（新）、卡那霉素（卡）、新生霉素（生）、氧氟沙星（嗪）、环丙沙星（环）、庆大霉素（庆）、先锋V （V ）、四环素（四）、链霉素（链）、复达欣（欣）、菌必治（菌）、林可霉素（林）、氨苄青霉素（氨）、青霉素G （青）、多粘菌素（多）、红霉素（红）、氯霉素（氯）。
实验方法采用药敏纸片供试片琼脂扩散法（K-B 法）。
其中分离率较高的细菌为肠杆菌科细菌（43.5%），弧菌科细菌（23%）；非发酵细菌（17.5%）；另外还分离到葡萄球菌、链球菌和真菌等，共占分离菌株的16%；由病原菌的分离可知, 南宁地区牛场的奶水牛子宫内膜炎同时存在着单一感染和混合感染，参与试验的105头奶水牛中由单一病原菌感染的奶水牛有51头，占48.6%（51/105），由两种或两种以上病原菌感染的奶水牛有
54头，占51.4%（54/105）。
2.2主要临床分离菌对常用抗菌药物的耐药性
在质控菌抑菌圈直径允许质控范围内，19种抗菌药物对已鉴定病原菌的抑菌圈平均直径见表2~6。
表2分离菌株普里毛斯沙雷氏菌鼠疫耶尔森氏菌液化沙雷氏菌美国爱文氏菌霍米奇肠杆菌
蜂房哈夫尼亚氏菌付甲伤寒沙门氏菌潘尼变形菌大肠埃希氏菌奇异变形菌
拉培格西蒂西菌弗劳地枸橼酸杆菌寒生克鲁瓦氏菌霍米奇肠杆菌咳痰塔特姆氏菌
11种抗菌药对肠杆菌科菌株抑菌圈直径
多
呋
新
卡
恩
氨
庆
氯
四
单位：mm
22.1
结果和分析病原菌鉴定结果
本试验对105头奶水牛子宫内容物进行病原菌的
V 23-[14]203225[15]201820-[16]183636
链
分离鉴定，除两头牛的子宫内容物未分离出病原菌外，其余牛的子宫内容物均分离到了病原菌，共分离出200个菌株，35种病原菌，具体分离菌株及检出率见表1，
表1
分离细菌司徒假单胞菌
弗劳地枸橼酸杆菌奇异变形菌拟态弧菌
液化沙雷氏菌霍米奇肠杆菌海鱼弧菌
辛辛那提弧菌付溶血弧菌大肠埃希氏菌
普里毛斯沙雷氏菌嗜麦芽假单胞菌亲水气单胞菌嗜热链球菌
人表皮葡萄球菌咳痰塔特姆氏菌拉培格西蒂西菌寒生克鲁瓦氏菌前庭链球菌猪链球菌
Vd 群无色杆菌白色隐球菌胶粘红酵母菌球形念珠菌罗伦隐球菌
金黄色葡萄球菌鼠疫耶尔森氏菌醋酸钙不动杆菌美国爱文氏菌伪产碱假单胞菌溶藻弧菌
付伤寒沙门氏菌潘尼变形菌
蜂房哈夫尼亚氏菌芳香黄杆菌
各分离菌株及检出率
分离株数
百分比（%）
[***********][***********]2211110.59.07.57.05.55.04.54.03.53.53.03.03.02.52.52.02.02.02.01.51.51.51.51.51.51.51.01.01.01.01.01.00.50.50.5
181412-[10]16[8]16162022-24--22[10]18202025[13]-20203520[16]20-3026[20][22]2330[20]2424[18]24[18][20]323030-[1**********]224-20-[***********]2422[14][1**********]4
-------------[***********]20[14]2020303032-[16]-20-18-28[20]-[14]282626[12]-[16]22[16]19242220[16]-[16][***********]201820---203030
注：[]：抑菌不彻底；-：已产生耐药性。
表3
分离菌株
11种抗菌药对弧菌科菌株抑菌圈直径多
红
新
卡
青氨庆
氯
恩
单位：mm 四
链
海鱼弧菌-[21]亲水气单胞菌--拟态弧菌[10]-付溶血弧菌1822溶藻弧菌1628辛辛那提弧菌-[18]
表4分离菌株醋酸钙不动杆菌司徒假单胞菌伪产碱假单胞菌芳香黄杆菌Vd 群无色杆菌嗜麦芽假单胞菌表5
2622-[18]18-[19][16]-2826-[22]20-[22]--------2320[16][12]20-25[17][14]
15[16]18[15]-24[16]22241628-2028[13]
23-[14]20-单位：mm 四
链
11种抗菌药对非发酵细菌菌株抑菌圈直径
恩多
红
新
卡
青氨庆
氯
24
[***********]2426[18]2621[22]2322[14][22]-2226282826-23[20][14]------
----
-20
2428352029--18[16]20[16][14][13]-30-272418[17]2316
13种抗菌药对葡萄球菌属和链球菌属菌株抑菌圈直径单位：mm
恩呋新
卡
生嗪环庆
分离菌株嗜热链球菌前庭链球菌
人表皮葡萄球菌金黄色葡萄球菌
V [16]262827
链欣菌青
[**************]2[20]-[20]24[20]22[18]24[16][15][16]2628-[11][**************]8[14]-[12]24-242024--1626-22-20-
由表2、3、4可见，肠杆菌科细菌、弧菌科细菌和非发酵细菌对氨苄青霉素、青霉素都产生了强耐药性，对氯霉素、多粘霉素、头孢呋辛、新霉素、卡那霉素、先锋V 、
··40
中国奶牛·2010年第6期
四环素、链霉素都有不同程度的耐药菌株出现；而对恩诺沙星、庆大霉素比较敏感。
表5所示，所有葡萄球菌属和链球菌属都对青霉素产生了很强的耐药性，对新霉素、卡那霉素、新生霉素和链霉素也产生了不同程度的耐药性；而对恩诺沙星、头孢呋辛、氧氟沙星、环丙沙星、菌必治、庆大霉素、先锋
多数为常见菌，有些可能只是继发性感染。至于具体哪种或哪几种病原菌是子宫内膜炎的直接致病菌，还有待进一步研究。
通过对分离鉴定的35种病原菌的耐药性分析，所有菌株都对临床上常用青霉素和氨苄青霉素产生了强耐药性；对氨基糖苷类药物链霉素和卡那霉素也产生了不同程度的耐药性；对喹诺酮类药物恩诺沙星具有极高的敏感性，对庆大霉素也有较好的敏感性，这与杜立银、李世平、赵树臣等的报道一致。然而若在临床上使用喹诺酮类抗生素来治疗子宫内膜炎，虽具有较好的抑菌效果，但价格昂贵，常给奶牛养殖场带来沉重的经济负担。因此，探索经济有效的治疗奶水牛子宫内膜炎的方法已是迫在眉睫。
参考文献
V 具有较高的敏感性。
酵母样真菌临床分离株对常用抗菌药物的耐药率见表6。由表6可见，本次试验所分离鉴定的酵母样真菌对除恩诺沙星、先锋V 和氧氟沙星较敏感外，对头孢呋辛、新霉素、卡那霉素、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、复达欣、菌必治、林可霉素均产生了一定的耐药性。
表6分离菌株球形念珠菌罗伦隐球菌白色隐球菌胶粘红酵母菌
12种抗菌药对酵母样真菌菌株抑菌圈直径恩呋
新卡嗪
环
庆
单位：mm 菌林
V [16]302236
链欣
24---2224242828[16][22]-3024[22]2220[20]-[14]-262222[10]1820[14]---16-24--[16]16[14]32----
[1][2][3]
张义冉, 汪恩强, 秦建华, 等. 河北省部分奶牛场奶牛子宫内膜炎病原菌分离与鉴定[J].畜牧与兽医2009，41（5）：86-88.
王京仁, 李淑红, 曾文虎, 等. 常德地区奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国兽医杂志2009，45(6)：38-39.
麻延峰，傅春泉，王宏艳，黄利权. 金华地区奶牛子宫内膜炎的血常规变化研究
3讨论
本试验分离鉴定的肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、假
[4][5][6][7][8][9]
[J].中国奶牛，2007，4：29-32.
许微微, 侯振中, 王海峰. 奶牛子宫内膜炎厌氧菌的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,
单胞菌、不动杆菌、变形杆菌、弧形菌、真菌等与报道的可引起奶牛子宫内膜炎的病原菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌、化脓棒状杆菌、摩氏杆菌、假单胞杆菌、变形杆菌、克雷伯氏菌、放线菌、蜡样芽孢杆菌等大体一致，又稍有差异，这可能与南宁地区湿热的气候及奶牛场的卫生条件和环境因素有关。统计此次奶水牛子宫内膜炎分离出单一菌株、两种及两种菌株以上的检出率分别为48.6%、34.3%、17.1%，说明南宁地区奶水牛子宫内膜炎主要为多种病原菌的混合感染。另外，前人报道曾从奶牛子宫内分离到了拟杆菌、梭菌、坏死杆菌和产黑色素拟杆菌等厌氧菌。由于受时间和条件的限制本试验没有进行厌氧菌的分离培养。本试验从患病奶水牛子宫中分离到了多种病原菌，但这并不能说明它们都是子宫内膜炎的直接致病因子。它们中
2007, (6):73-74.
张维军，赵宏坤，杨少华, 等. 奶牛子宫内膜炎致病菌的分离与鉴定及耐药性分析[J].中国畜牧兽医，2006，33（11）：28-31.
王建发，林玉才，等. 子宫刮片法检测奶牛子宫内膜炎的方法介绍[J].中国奶牛，
2009，7：36-38.
张彦明. 牛子宫内膜炎的研究与临床进展[J]. 黄牛杂志,1998,24(1):34-37.曹伯宏, 吴雅玲. 奶牛子宫炎的诊断治疗及预防[J].青海畜牧兽医杂志,2004,34
(1):34-36.
和
翼，武瑞，等. 防治奶牛子宫内膜炎复方药物对大鼠血清NO 含量及NOS 活性影响的研究[J].中国奶牛，2008，1：15-17.
[10]张丽云，李继连. 氟苯尼考混悬剂对奶牛子宫内膜炎的疗效试验[J].中国奶牛，
2008，2：29-31.
[11]赵树臣, 许微微, 李培锋, 等. 奶牛子宫内膜炎致病菌的药敏试验[J].中国兽医杂志，
2008,44(10):42-43.
[12]李世平，杜小丽，蒲万霞, 等．奶牛子宫内膜炎常见病原菌药物敏感试验[J].中国
医药杂志，196，2：9-11．
[13]邱刚，芮亚培. 纳米银对奶牛子宫内膜炎的临床治疗试验[J].中国奶牛，2008，4：
39-41.
[14]杜立银，田文儒，王洪成, 等. 恩诺沙星和乳酸环丙沙星治疗奶牛子宫内膜炎的
临床观察[J].黑龙江畜牧兽医，1997，4：20-22.
Identification and Drug Sensitivity Test of Pathogenic Bacterium of Endometritis in Dairy Buffalo
Gao Yumei 1, He Baoxiang 1, Qin Guangsheng 2, Yang Xianling 1, Zheng Wei 2
（1. Animal Science and Technology College, Guangxi University, Nanning
530004;
2. Buffalo Research Institute of Guangxi, Nanning 530004）
Abstract ：105dairy buffalo with endometritis in Nanning region were investigated, a total of two hundreds pathogenic bacterium were
isolated and drug sensitivity test were carried out. The result showed that the most frequently isolated bacteria were Enterobacteriaceae (87strains/43.5%),Vibrionaceae (46strains/23%),Nonfermenters (35strains/17.5%),and 32strains(16%)of Staphylococcus , Streptococcus and Fungi were also isolated, and most of which were mixed infections. The result of drug -sensitive test indicated that majority of pathogen showed sensitive to Enrofloxacin and Gentamicin, but strong drug-resistant to Penicillin and Ampicillin, also resistant to Aminoglycoside such as Streptomycin and Kanamycin in different degree.
Key words ：Endometritis ；Pathogenic bacterium ；Drug sensitivity test ；Dairy buffalo