比较南瓜,西葫芦的糖,蛋白质含量

西葫芦、南瓜中可溶性蛋白质和糖含量的测

定和探讨

姓名：潘佳佳同组者：康晓琳，韩二琴 指导教师：单树花

（太原师范学院 生物系101班 ，学号 2010131143）

摘要：采用考马斯亮蓝G-250染色法测定西葫芦、南瓜中蛋白质的含量分别是：2.201mg/g,11.077mg/g采用蒽酮法测定南瓜、西葫芦中可溶性糖的含量分别是：49.44mg/g,112.37mg/g实验表明南瓜中含有的糖分, 蛋白质均较西葫芦丰富，而它们中各自糖含量多于蛋白质。 关键词：；西葫芦；南瓜；蛋白质；糖；含量 引言 ：

考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量测定

作者：吕淑霞 来源：生物秀 时间：2008-5-21

一、目的

学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。 二、原理

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm ；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL ，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 二、材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 新鲜绿豆芽 2．主要仪器

（1）分析天平、台式天平 （2）刻度吸管

（3）具塞试管、试管架 （4）研钵

（5）离心机、离心管 （6）烧杯、量筒 （7）微量取样器 （8）分光光度计 3．试剂

（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。 （2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％

乙醇中，加入85％（W ／V ）的磷酸100mL ，最后用蒸馏水定容到1 000mL 。此溶液在常温下可放置一个月。 （3）乙醇

（4）磷酸（85％） 四、操作步骤 1．标准曲线制作

（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm ，并做标准曲线。 表1 低浓度标准曲线制作

（2）0~1 000μg／mL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1 000μg／mL 的标准曲线。 表2 高浓度标准曲线制作

2．样品提取液中蛋白质浓度的测定

（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h 以充分提取，然后在4 000r/min 离心20min ，弃去沉淀，上清液转入10mL 容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

（2）测定：另取2 支10mL 具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL （做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD 595nm ，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X （μg）。以标准曲线1 号试管做空白。

五、结果计算

式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。 六、附 注

1．Bradford 法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

2．有些阳离子，如K +、Na +、Mg 2+、(NH4) 2SO 4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。

3．蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其 结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。 七、思考题

1．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？

植物组织中可溶性糖含量测定

植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。 （一）苯酚法测定可溶性糖 【实验原理】

植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min 以上。 【实验仪器及试剂】

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL 刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。

2．试剂：

（1）90％苯酚溶液：称取90g 苯酚（AR ），加蒸馏水10mL 溶解，在室温下可保存数月。 （2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL ，现配现用。 （3）浓硫酸（比重1.84）。

（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g 。加少量水溶解，移入100mL 容量瓶中，加入0.5mL 浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。

（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL 加入100mL 容量瓶中，加水定容。 【实验步骤】

1．标准曲线的制作： 取20mL 刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s 。加入5 mL 浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL ，在恒温下放置30min 。显色。然后以空白为参比，在485nm 波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g ，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min （提取2次），提取液过滤入25mL 容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。 3．测定吸取0.5mL 样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL ，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。

式中：C 一标准方程求得糖量（ug ） α一吸取样品液体积（mL ） V －提取液量（mL ） n 一稀释倍数

W 一组织重量（g ）

（二） 蒽酮法测定可溶性糖 【实验原理】

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应X 所以用愈酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用意酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。

糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm ，故在此波长下进行比色。 【实验仪器及试剂】

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20ml 刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。 2．试剂：

（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g ，溶于50mL 乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数周，如有结晶析出，可微热溶解。 （2）浓硫酸（比重1.84） 【实验步骤】

1．标准曲线的制作：按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5mL 蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL 浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1min 取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm 波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。 2．可溶性糖的提取同方法一第二步。

3．显色测定：吸取样品提取液0.5mL 于20mL 刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL ，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。 4．计算可溶性糖的含量，计算公式同方法一

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

实验材料为西葫芦、南瓜样品。

标准蛋白质溶液:由25mg 牛血清蛋白加水稀释而成。

考马斯亮蓝试剂:100mg考马斯亮蓝，95%乙醇，85%磷酸加蒸馏水混合而成。 标准葡萄糖溶液：由100mg 葡萄糖加水稀释而成。 蒽酮试剂：1g 蒽酮，乙酸乙酯混合而成。 1.2 方法

a. 蛋白质标准曲线的绘制

取6支试管，按下表加入试剂后，在向各管中加入5ml 考马斯亮蓝试剂，5min 后，以0管为空白对照，在595nm 下比色测定吸光值。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

b. 蛋白质样品的测定

分别取西葫芦、南瓜各0.5g ，用5ml 蒸馏水研磨成浆后，3000r/min离心10min, 测上清液总体积。吸取样品提取液1.0ml 稀释，加入5ml 考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置两分钟后在595nm 下比色，测吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 1.3. 糖类样品的测定

a. 糖类标准曲线的绘制

取6支具塞试管，按下表加入试剂后，在向各管中加入0.5ml 蒽酮试剂，再缓慢加入5ml 浓硫酸，在沸水浴中煮沸10min 后冷却。在620nm 下比色测定吸光值。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

b.糖类样品的测定

分别取西葫芦、南瓜各1g ，置于研钵中，用5ml 蒸馏水研磨成浆，然后转入20ml 试管中，用5ml 蒸馏水充分洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10min ，冷却后在4000r/min下离心10min ，滤液收集到100ml

容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。

用移液管吸取1ml 提取液于20ml 具塞刻度试管中，加1ml 水和0.5ml 蒽酮试剂，再缓慢加入5ml 浓硫酸，盖上试管塞后摇匀，再置沸水浴中10min ，冷却至室温，在波长620nm 下比色，测定吸光值。并通过标准曲线得知相应的葡萄糖含量。

2 观测结果

2.1蛋白质和糖类标准曲线： 各管中标准蛋白质的吸光值见表1

各管中标准葡萄糖的吸光值见表2

表2 各试管中标准葡萄糖的吸光值

蛋白质标准曲线的绘制：y=0.000485x-0.0185

多糖标准曲线的绘制：

y=0.003275x-0.0162

2.2西葫芦、菜花中蛋白质和糖吸光度：

2.3计算结果

（1）样品中蛋白质的含量=C*VT／（VS*WF*1000）

C ——查标准曲线值， ug VT ——提取液总体积， ml VF ——测样时加样量，ml

将西葫芦蛋白质吸光值代入y=0.000485x-0.0185,得x=236.08 所以西葫芦中蛋白质的含量=2.201（mg/g）

将南瓜蛋白质吸光值代入y=0.000485x-0.0185，得x=1370.10 所以南瓜中蛋白质的含量=11.077（mg/g）

6

将西葫芦糖类吸光度代入y=0.003275x-0.0162，得x=404.641 所以西葫芦中糖含量=4.944（g/100g鲜重）=49.44mg/g 将南瓜糖类吸光度代入y=0.003275x-0.0162，得x=748.763

所以南瓜中糖含量=11.237（g/100g鲜重）=112.370mg/g

3讨论

3.1不同种植物体内糖含量的比较：

通过南瓜、西葫芦中可溶性糖的含量分别是：49.44mg/g,112.37mg/g得出南瓜糖含

量丰富，这有我们日常饮食也可以感到南瓜很甜，西葫芦则次之，所以一些病人如糖尿病人应该少摄取南瓜。

3.2不同种植物体内蛋白质含量的比较：

通过西葫芦、南瓜中蛋白质的含量分别是：2.201mg/g,11.077mg/g得出南瓜的蛋白质含量也比西葫芦的高。

3.3同种植物蛋白质，糖含量的比较：

不论西葫芦，南瓜中糖都比蛋白质的含量高很多，大致得出大部分植物都是糖含量高于蛋白质含量。 参考文献

百度文库：《考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量测定》作者：吕淑霞 百度文库：《植物组织中可溶性糖含量测定》