HPLC在海洋船舶涂料防污剂检测中的应用

狄兰兰1, 蔺存国2, 郑纪勇2, 张桂玲1

( 1.中国海洋大学化学化工学院, 山东青岛266100;2.海洋腐蚀与防护国防科技重点实验室, 中国船舶重工集团公司第七二五研究所, 山东青岛266071)

0 引 言

高效液相色谱法是在20世纪60年代末期在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的新型分离分析技术。20世纪60年代末, 随着色谱理论的发展, 色谱工作者已经认识到采用微粒固定相是提高柱效的重要途径, 液相色谱仪制造商在借鉴了气相色谱仪研制经验的基础上, 成功地制造了高压输液泵和高灵敏度检测器, 从而使液相色谱法获得了新生。HPLC法使用了全多孔微粒固定相, 装填在小口径、不锈钢短柱内, 流动相通过高压输液泵进入高柱压色谱柱内, 溶质在固定相传播, 扩散速度大大加快, 从而在短时间内获得高柱效和高分离能力。HPLC可用于难挥发、极性较强物质的分析。据估计, GC( 气相色谱法)方法仅能对20% 左右有机物进行分析, 而80%左右的有机物可用HPLC方法进行分析。在船舶涂料防污剂检测方面的应用也相当广泛, 例如传统有机锡涂料释放及代谢产物在海水中含量的测定, 由于环境的需要, 近年来在测定低毒防污涂料助剂的释放和代谢产物含量以及无毒新型防污剂开发的分离检测上也有非常广泛的应用。

1 有毒涂料防污剂有机锡的HPLC分析

有机锡早期应用在船舶防污涂料抑制海洋生物污损中发挥了非常有效的作用, 但随着海洋监测技术的发展, 有机锡的毒性和对生态系统的危害越来越多地被人类认识。例如: 导致海洋生物的性别畸变严重危害生态系统的平衡[ 1] 。对于有机锡类化合物的分析方法有很多种。由于有机锡既含有金属元素, 又具有有机物的性质。因此, 现在的方法是将有机物技术如GC、H PLC、超临界流体色谱( SFC ) 与一些检测技术如原子吸收( AAS) 、原子发射( AES) 和质谱(MS )联用。海洋环境中的有机锡浓度很低( 10- 12 ~ 10- 9 ) , 而且种类繁多, 因此用传统的仪器很难满足高灵敏度、高选择性分析要求。其中较成熟的方法是以GC 为分离手段, 配以适合金属离子分析的检测器[2] 。

H PLC 能对不适应GC 的有机锡进行分析, 适用于大多数极性及非极性有机锡化合物的直接分离。与GC相比, H PLC具有以下特点: 首先, 不需萃取及衍生, 在常温下可直接分离样品中不同形态的锡, 不但缩短了分析时间, 而且还减少了分析过程中可能的损失; 其次, 可通过改变固定相和流动相获得最佳分离, 第三, 尤其适用于具有生物活性化合物的分离与形态分析[ 3] 。

( 1)高效液相色谱和原子吸收( H PLC - AAS ) 联用: 火焰原子吸收( FAAS) 可直接与HPLC 联用并提供在线分析。

HPLC通常的流速为0?? 5~ 2 mL/m in, 而喷雾到AAS的流速一般为4~ 8 mL /m in, 故通常通过在T 型接口加入溶剂或气体来平衡柱流出液和喷雾器的提升流速。因此喷雾装置为整个HPLC- AAS系统中最薄弱的一环, 雾化效率经常仅为5% ~15%, 为提高对有机锡的程度灵敏度, 常采用柱后氢化技术。与FAAS低雾化效率相比, 石墨炉火焰原子吸收法( GFAAS )因石墨炉原子化效率较高而具有比较理想的灵敏度。但由于单次热循环的局限, 柱流出液被一次完全干燥, 若在线连接, 1200 oc 以上的连续高温会将石英管烧坏; 1 200 ?? 以下的温度只能测定氢化有机锡, 加入氢气发生器使仪器连接烦琐, 故HPLC与GFAAS在线联用只能设计为半连续分立系统。影响联用的因素包括有机溶剂效应及原子化不太完全的问题, 消除方法有[ 4] : 分析前溶液的化学反应法; 对石墨炉构造重新优化设计; 改进石墨炉表面和进行离线测定。与HPLC- FAAS相比, 虽然H PLC - FAAS具有操作简单、价格便宜等特点, 但是它的检出限不能满足需要。而采用HPLC- GFAAS其检出限比HPLC- FAAS降低了3 个数量级, 同时还消除了不易形成氢化物物质的干扰。

( 2)高效液相色谱和等离子体发射光谱( H PLC - ICPAES)联用: 以感应耦合等离子体( ICP)为激发源的AES 法由于原子化率较大, 因此灵敏度高于各种火焰法。AES 光谱线性范围宽, 可同时进行多元素测定。ICP- AES 的试样引进系统多为气动雾化装置, 但一般雾化效率仅有10%左右, 且ICP对引入的HPLC有机溶剂虽已气动雾化, 但耐受性能较差, 有机溶剂常以不完全雾化的气溶胶形式聚集在等离子体炬焰中, 极大影响炬焰的稳定性及激发特性。因此, ICP- AES 与HPLC 联用的主要问题在于尽量克服由雾化效率低和有机溶剂效应引起的色谱峰的展宽[ 1]。利用有机锡卤化物较易形成氢化物的性质, HPLC - ICP- AES 在线测定有机锡常采用在线氢化衍生的方法, ICP 雾化器兼作气- 液分离器, 从而实现了提高雾化效率及去溶剂化和改善峰形的目的。检测限可达ng级[ 5] 。

( 3)高效液相色谱和等离子体质谱(H PLC - ICP- MS) 联用: ICP是M S 非常有效的离子源。ICP - M S 能很好地与HPLC流动相的流速( 0?? 1~ 1 mL /m in) 相匹配。对于有机金属形态分析的研究HPLC - ICP - M S 是最成功的联用系统。HPLC- ICP- MS 联用技术所显示的诸多优点吸引了人们的注意力, 致使近年来这方面的研究不断增加。ICP - M S系统主要问题是喷雾器的效率, 应用HPLC- DIN - ICP- M S系统,以微型LC填充柱及直接进样雾化系统( DIN ) 降低有机溶剂的量及使体积降低到不影响峰展宽的程度等, 这些工作在分别对丁基锡、甲基锡等各种形态的测定中, 大多数取得了pg级的检测下限[ 3] 。

2 涂料中低毒有机助防污剂的HPLC分析

目前在国际上获得认可的低毒有机助防污剂主要有敌草隆、Irgaro l 1051、Ka thon 5287、TCMTB、TCMS 吡啶[ 6] , 这部分物质也用作农用杀虫剂。迄今为止, 有机杀生物剂单独用作船舶防污尚未见报道, 它们仅作为铜系和有机锡等防污涂料的辅助防污剂, 因此称之为有机助防污剂。铜系化合物对藤壶类、栖管虫以及大部分藻类等有防污活性, 但对几种藻类如浒苔类、水云类和弯杆藻类等无效。因此铜系化合物作防污剂应与其他有机助防污剂结合在一起使用, 这样才能在防污漆里达到广谱性杀伤海洋附着生物的作用。

2. 1 敌草隆、Irgaro l 1051

因为敌草隆和Irgaro l 1051在海水和海洋沉积物中的含量都仅有u g /L级, 高效液相色谱法的灵敏度高、检测限低适用于测定此类物质。GC 也可以测定敌草隆, 但测定前需先对其进行修饰避免加热分解, 而HPLC 法则省去了修饰这一步, 从而测定步骤更简单[ 7] 。敌草隆主要通过HPLC 进行定量, 国内有利用HPLC - UV 测定肉类中敌草隆的报道, 采用RP -C18柱, 流动相甲醇:水= 1:1, UV检测波长254 nm[ 8] 。H PLC- PDA 可用于敌草隆和Irgaro l 1051 的同时检测, PDA 是紫外检测器的一种, 不仅可以得到色谱信息, 而且可以得到化合物的实时光谱信息。新型PDA检测器可以在1.2 nm 高分辨率下获得高灵敏度检测, 获得高质量的光谱信息[ 9] 。上述特点不仅使之可用于高灵敏度检测, 而且可以用于化合物的光谱确认。此外, 亦可收集多通道2D 色谱图, 对于优化多种不同

残留物质检测波长提供了极大的方便。敌草隆和Irgaro l 1051作为防污剂使用, 在海水或海泥中的降解情况是评价防污剂是否长期有毒的重要指标。敌草隆和Irgaro l 1051及其降解产物在海水和沉积物中含量主要用H PLC - PAD法测定[ 10] 。

许多研究文献表明Irgaro l 1051光降解、生物降解和化学分解的产物都是M 1[ 11] , 敌草隆在有氧条件下的降解产物包括DCPMU、DCPU 和DCA[ 12]。

H PLC 测定方法为: 海水和沉积物样品的HPLC测定条件大体相同, 保护柱和萃取柱填充Zo rbax SB - C18, 柱温30 oc ,流动相组成为乙腈和水(M illiQ ), 通过在25 m in内改变流动相的组成由20% 乙腈至100% 乙腈进行梯度洗脱, 流速1.7 mL /m in。二极管阵列检测器设定Irga ro l 1051 和M1 为224 nm, 敌草隆及其代谢产物为244 nm。此试验方法无论在海水还是沉积物中大部分的物质都获得了满意的回收率和检测限[ 10]。2. 2 Kathon 5287、TCMTB和TCMS吡啶

文献研究中表明HPLC 是测定K athon 5287最适合的方法。而TCMTB 热不稳定, 可通过GC 测定其水解产物间接测定, 但仍有一系列的干扰问题有待排除, 而使用HPLC 不需要对TCMTB水解即可测定TCMTB, 方法更简便。而且HPLC -UV(高效液相色谱- 紫外检测器) 还可以实现TCMTB和TC-M S吡啶同时测定, 检测限为1 000 ng /L[ 7] 。H PLC- APC I-M S( 高效液相色谱大气压化学电离质谱)方法还能得到更低的检测限, 且质谱检测器可以同时检测更多种样品, 且具有高灵敏度, 可以获得不同于常规H PLC 检测器的大量而丰富的结构信息[ 9] 。

大气压化学电离( APCI)是喷雾型的软电离技术(电离后产生简单的质谱图常由质子化分子[M + H ] + 和负质子化分子[M - H ] - 组成), 它的高电离效率已成为目前最理想的LC /M S接口。它的灵敏度高, 可以测出小于1皮摩尔的蛋白质及几十皮克农药[ 13] 。

HPLC- APC I- M S是目前分析环境中低浓度物质(如杀虫剂类)最有效的方法。基于HPLC和LC /APCI /M S的优点, K athon 5287、TCMTB、TCMS吡啶和敌草隆可以通过HPLC- APCI- MS 同时进行分析。常采用的方法是: 先使用C18柱进行固相萃取, 然后采用反相高效液相色谱- 极性转换大气压质谱对样品定量定性分析。

HPLC条件: 采用ENV反相柱, 柱温: 50 oc , 流动相:乙腈:水= 10:90, 注入25 uL样品与流动相平衡5 m in, 流动相线性变化至100%乙腈梯度洗脱。

质谱条件: 正电离, 电晕3??2 kV, 高压透镜0 kV, 离子能量2. 0 V; 负电离, 电晕1.8 kV, 高压透镜0 kV, 离子能量2. 0 V;源温度150 oc , 探针温度400 oc , 低质量分辨率12. 5, 高质量分辨率12.5, 离子能量2.0 V。

HPLC- APCI- M S检测限可达ng /L 级, kathon 5287 可达到1 ng /L, TCMTB 可达到1 ng /L, TCM S 吡啶可达到5 ng /L[ 14] 。利用这种方法可以灵敏的分析海域不同的码头中3 种防污助剂的浓度, 从而对其进行评价。

3. 新型无毒涂料防污剂辣椒素的HPLC -UV检测

辣椒素广泛应用于食品工业和医药领域, 同时辣椒素可用作天然农用杀虫剂, 由于其杀虫抑菌的功效目前也应用于船舶防污涂料中, 是近年来出现的新型无毒防污剂。这类无毒防污剂虽不具有杀灭生物活性的物质, 但有高度的麻醉性、忌避性以及阻碍附着的性能。

辣椒素是含酚羟基的生物碱。大约有14种香草基物质组成, 其中有3种(辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱)的组成和含量之和接近99%。纯品通常情况下为白色针状微晶体, 熔点65oc , 无毒, 刺激性很强, 易溶于甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯及碱性水溶液, 难溶于冷水。化学稳定性高, 在各种有机溶剂萃取过程中损失极少。

3.1 辣椒素制备方法

溶剂法, 以干红辣椒粉为原料, 用有机溶剂浸取、过滤、蒸馏、回收等制得辣椒油树脂, 再经乙醚、稀乙醇碱性水溶液等进一步抽提浓缩后, 经石油醚或正己烷结晶得到辣椒素晶体。也可通过吸附柱层析法、超临界二氧化碳法制备[ 15] 。

3.2 辣椒素的HPLC- UV 检测方法

色谱条件: H ypersilODS C18( 5 um, 250 mm x 4.6 mm );UV检测波长: 280 nm; 流速: 1. 0 mL /m in; 柱温: 35 oc ; 流动相:CH3OH:H 2O (含1%磷酸) = 55:45。精密称取样品9.82 m g,用甲醇溶解定容到100 mL, 进样量20 uL。样品经分离进入检测器, 由样品的检测信号和标样对比得到得到相应组分含量。H PLC 法选取98%的辣椒碱、97% 的二氢辣椒碱和90%的降二氢辣椒碱作为标样。采用峰高外标法分别分析样品中3个主要组分的含量。因为3种主要组分的含量> 97%, 因此3种主要组分含量的加和就得到辣椒素的含量。有相关资料建议采用H PLC 时最好用反相柱, 因为辣素中各类辣椒碱化和物的区别仅仅在于烷基侧链的区别[ 16] 。图1为辣椒素晶体的HPLC图。

图中tR: 13.332、14.632、21.865分别是降二氢辣椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱的保留时间, 由此可见H PLC 法可将3种主要成分完全分开。H PLC 对同一样品重复进样10次, 统计峰面积, 峰面积再现性良好, 不仅可以得出辣椒素的含量, 而且可以得出3个主要成分辣椒碱、降二氢辣椒碱、二氢辣椒碱的含量, 突破了以往仅测定单一组分的限制[17]。该方法适用于各种辣椒制品的辣椒素分析, 但对设备要求较高, 并且需要标样。对辣椒油树脂和晶体辣椒素建议采用高效液相色谱法, 但对于辣椒皮粉辣椒含量检测采用紫外方法比较经济简便[ 8] 。

4 结 语

由船舶防污涂料中释放出的防污剂对海洋环境的影响备受关注。防污剂及其降解产物在海洋中的残留量的监测为防污剂对海洋环境影响强度的评价提供了有效的依据。H PLC方法及其联用技术因其高灵敏度、准确快速、与GC 相比分析对象更宽广的分析特点, 在测定环境中各种防污剂及其降解产物的含量上得到越来越广泛的应用。随着各种联用技术的发展, HPLC法测定物质的范围将更宽, 检测限也将进一步降低。H PLC 在无毒防污剂的开发中也起着重要的作用, 比如天然提取产物中具有防污效果成分的分离制备, 但对天然提取混合物色谱分离检测条件的探索也是一个相当困难且至关重要的环节。如HPLC- APC I- M S检测限可达ng /L级, 且M S可获得被分离组分的结构信息, 能够实现最快速最灵敏的分析。

总之, H PLC 法的广泛应用依托于更强大的检测器、联用技术的发展。此外, 在对混合物色谱分离条件的探索中, 丰富的实验经验和H PLC知识也是不可或缺的。