选择正确的缓冲液

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选择正确的缓冲溶液

右表所示为常用缓冲溶液系统表。表中列出常用缓冲溶液系统

pKa 一部分常用缓冲溶液及其相应的pH 值。其缓冲 pH 有效是否

中，最常用的是磷酸盐。作为一种缓冲溶液，溶液 缓冲范适用当不同pH 值的样品加入到其中时，应当具围 与MS 有保持pH 稳定的能力。同时，缓冲溶液的0.30 三氟 是 缓冲容量为酸或碱的pK 值上下浮动100%。乙酸 在pH ＝4时，磷酸盐时一种弱的缓冲溶液，2.1 1.1-3.1 磷酸pK 1 否 如果一种酸性或碱性更强的样品加入到其盐 pK 2 7.2 6.2-8.2 否 中，其pH 值会迅速朝着它的一个pKa 值变pK 3 12.3 11.3-13.3 否 化。 3.1 2.1-4.1 柠檬pK 1 否

通常，为保持流动相pH 值的稳定，流酸盐 pK 2 4.7 3.7-5.7 否 动相的pH 值应控制在其pKa±1的范围之pK 3 5.4 4.4-6.4 否 内。在HPLC 中，常用的缓冲溶液浓度为3.8 4.4-6.4 甲酸 是 10-100mM 。具体的浓度取决于样品的尺寸盐 和性质，以及色谱柱的填料。通常，含有极4.8 3.8-5.8 醋酸 是 性基团的固定相，如Hypersil Gold aQ ，比盐 传统的烷基填料更适于在稀的缓冲溶液中7.3-9.3 三氨基甲烷盐8.3 是 使用。 酸缓冲液

若想控制流动相在一个低的pH 值范围

9.2 8.2-10.2 是 氨

(2-3)，通常会选择使用磷酸盐、或较强的有

9.2 8.2-10.2 否 硼酸

机酸，如TFA 或醋酸。若希望控制在pH4-5，

盐

醋酸盐或柠檬酸盐而不是磷酸盐，是通常考

10.5 9.5-11.5 是 二乙

虑使用的试剂。

胺

右图所示为pH 值选择对分离的重要

6.4 碳酸pK 1 是

性。如果不能正确缓冲，即使pH 值微小变

盐 pK 2 10.2 是

化，由测量的误差、泵混合物或者流动相吸

7.80 三乙 是

收空气中的水所造成的变化，都会改变方

醇胺

法。

当选择一种缓冲溶液和有机溶剂混合时，应注意它们的互溶性，避免出现混合后缓冲盐结晶析出从而造成系统污染的情况。

实验完成后，应及时冲洗仪器和色谱柱，以防止缓冲盐沉积在系统或筛板上。

pH 的微小变化对微离子化混合物分离

的影响

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LC/MS缓冲溶液选择

缓冲溶液的选择很大程度上取决于所使用的仪器和分析物。理想地，LC/MS系统中应使用易挥发的缓冲溶液以避免形成污染 源极的沉积。无机酸、不挥发的缓冲溶液以及离子对试剂应避免使用。常用的LC/MS缓冲溶液包括：

● 醋酸铵/甲酸盐/碳酸氢盐(

● 叔胺(

● BIS-TRIS 丙烷

提示：我公司可提供LC/MS仪器，如 Finnigan Surveyor MSQ LC/MS。该系统中加入了自清洗装置以减小常规使用中无机盐在源极上的累积。使用过程中应当注意，不要故意过度污染仪器的源极，因为这可能会导致操作上的问题。

流动相的准备

正确准备溶剂是十分重要的，它能在减少鬼峰和基线噪声问题上，节约大量时间。 质量

所有溶剂都应是高纯度的，HPLC 级的溶剂的价格会比其它纯度的溶剂稍贵一些，但是它们的纯度是不同的。HPLC 级溶剂一般不会产生鬼峰，而其它级溶剂可能会由于杂质的存在而产生鬼峰。

保证配制流动相的水的纯度足够高，由于去离子水经常含有一些有机化合物，因此不推荐用于HPLC 中。超纯HPLC 用水（18MΩ）是由去离子水通过离子交换床得到。现代的水净化仪器即是利用这一机理来大量生产这种纯水。HPLC 纯水也可以从溶剂经销商处买到。

重要提示：不要把HPLC 纯水存放于塑料容器中，因为塑料中的添加剂可能会渗入水中造成污染。通常用玻璃瓶存储HPLC 纯水。 缓冲溶液

所有的缓冲溶液都应是现用现配的，这样能确保不会因为缓冲溶液储藏时间过长使流动相的pH 受到影响，同时也可避免微生物生长。pH 的改变和微生物都可能会影响色谱分离效果。

缓冲溶液储存应该有一定的时间限制。药典或者相关的资料都有一些相关要求。

缓冲溶液可能包含稳定剂，例如：硫代硫酸钠。这些稳定剂可能会影响缓冲溶液在光学和色谱方面的性能，因此，比较理想的是购买没有添加稳定剂的溶剂。重复使用的固体试剂容器很容易被污染。所以推荐买小容量容器装溶剂。 过滤

理想情况下，要求所有HPLC 用溶剂都应通过0.45μm的滤膜过滤后再用。这样能够有效防止微粒导致的堵塞。过滤后，应把溶剂放在一个密封的容器中，防止灰尘等所造成的重新污染。过滤后的溶剂既可做色谱分析，也可冲洗系统。譬如，泵头、柱塞杆、单向阀和密封圈，都应该最大程度上处理好，保持良好性能状态。 脱气

在流动相进入HPLC 系统中之前，应首先脱气。常用的流动相脱气方法有： ● 氦气脱气

● 超声脱气 ● 真空脱气。

如果流动相没有脱气，那么进入到高压系统的气泡会使系统不稳，出现鬼峰等。

流动相中的气体引起的基线噪声

氦气或其他低溶解度气体是有效的脱气方法，流动相连续脱气可以防止空气重新溶解在溶剂中从而对实验产生影响。

注意：确保溶剂瓶里有孔与大气相通，以防止溶剂瓶内部有压力。

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溶剂性质(vs硅胶) 溶剂 溶剂强度1 极性指紫外截止折光率2 粘度3 沸点3(℃) 水溶性

2

(nm) (cP,20℃) (w/w%) 数 氟利昂 正己烷 异辛烷 正庚烷 正癸烷 环己烷 环戊烷 1- 氯丁

烷 正丁醚 邻二甲苯 异丙醚 甲苯 甲基叔二丁醚 正丁醇 氯仿 二氯甲烷 甲基丁基酮

四氢呋喃 环己酮 甲基乙基酮 甲氧醚环己醇 丙酮 二氧六环 乙酸乙酯 乙酸甲酯 二甲亚砜 N,N’-二甲基甲酰胺 硝基甲烷 乙腈 N,N’-二甲基乙酰胺 N-甲基酰胺 正丙醇(1-丙醇) 异丙醇(2-丙醇) 乙醇 甲醇 乙二醇 醋酸 水

互溶 互溶 互溶 互溶 互溶 互溶

互溶

互溶 互溶 互溶 互溶 互溶 互溶

1. L.R. Snyder, J. Chromatogr. Sci., 16 (1978) 223

2. Burdick and Jackson reference tables (wavelength at 1.0 absorbance units). 3. CRC Handbook of Chemistry and Physics.

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不相溶的

那些阴影方格所示“不相溶”是指，两种溶剂在某种比例下混合，会产生两相。

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发色团检测波长

发色团是光吸收基团，可利用其测定分析物。分析物通常有一个或多个检测波长，每个检测波长都有与其相应的摩尔吸收系数。下表是部分常用发色团的相关信息，可供色谱分析参考。

发色团 结构 λmax (nm) εmax(L/m/cm)

炔 -C≡C- 175-180 6000 醛 -CHO 210 强 280-300 11-18 胺 -NH 2 195 2800 酰胺 >C=N- 190 5000 偶氮 -N=N-

285-400 3-25 苯

184 46,700 202 6,900

255 170 羧基 -COOH 200-210 50-70 酯 -COOR 205 50 醚

-O- 185

1000

烯 -C=C- 190 8000 酮

>C=O 195 270-285 1000 18-30 萘

22

0 275

312 112,000

175 5600

硝酸盐 -ONO 2 270 12

-(C=C)-无环 210-230 21,000 -(C=C)3 260 35,000 C=C-C=C 219 6,500 C=C-C=N 220 23,000 C=C-C=O 210-250 10,000-20,000

C=C-NO2 300-350 弱 氰

-C≡N 160

-ONO 220-230 1000-2000

300-400 10

硝基

-NO 2

210

强

亚硝基 -N=O 肟

-NOH

302 100 190

5000

174 195

251 80,000 6,000

1,700 砜 -SO2- 180 亚砜 >S-O 210 1500 硫醚 -S- 194 215 4600 1600 硫醇

-SH 195 1400 P191

色谱柱的清洗和再生

色谱柱的柱效可参照色谱柱供应厂商所提供的条件进行测试。应在清洗过程开始和结束时各测一次柱效和容量因子等，比较色谱柱性能的改善，以确定清洗的效果。 除非特殊

说明，在所有情况下所用溶剂的体积应该是色谱柱体积的40-60倍。确保色谱柱中没有样品和缓冲溶液，清洗前所用的溶剂应与最初清洗时所用的溶剂相溶。色谱柱清洗完成后，应确认实验测试时所用的流动相与色谱柱中最后的溶剂相溶。 正相填料

1. 用四氢呋喃冲洗；

2. 用甲醇冲洗；

3. 用四氢呋喃冲洗； 4. 二氯甲烷冲洗；

5. 用无苯正己烷冲洗。

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色谱柱的清洗和再生

色谱柱的柱效可参照色谱柱供应厂商所提供的条件进行测试。应在清洗过程开始和结束时各测一次柱效和容量因子等，比较色谱柱性能的改善，以确定清洗的效果。

除非特殊说明，在所有情况下所用溶剂的体积应该是色谱柱体积的40-60倍。确保色谱柱中没有样品和缓冲溶液，清洗前所用的溶剂应与最初清洗时所用的溶剂相溶。色谱柱清洗完成后，应确认实验测试时所用的流动相与色谱柱中最后的溶剂相溶。 正相填料

1. 用四氢呋喃冲洗； 2. 用甲醇冲洗；

3. 用四氢呋喃冲洗； 4. 二氯甲烷冲洗； 5. 用无苯正己烷冲洗。 反相填料

1. 用HPLC 级水冲洗，冲洗时进4等份的200µL 的二甲亚砜（DMSO ）； 2. 用甲醇冲洗；

3. 用氯仿冲洗； 2. 用甲醇冲洗； 3. 用氯仿冲洗； 4. 用甲醇冲洗。 阴离子交换填料 1.用HPLC 级水冲洗； 2.用50mM 到1M 适当的缓冲溶液梯度冲洗； 3.用HPLC 级水冲洗； 4.用甲醇冲洗； 5.用氯仿冲洗。 阳离子交换填料 1.用HPLC 级水冲洗；在冲洗的过程中进4等份200 L 的DMSO ； 2.四氢呋喃冲洗。 蛋白质尺寸排阻填料 去除蛋白质尺寸排阻介质中的污染物有两种清洗/再生的方法。 弱保留蛋白质 1.用30mL 0.1M pH3.0磷酸盐缓冲液冲洗。 强保留蛋白质 1.用100%的水到100%的乙腈梯度洗脱60min 。 多孔石墨化碳 多孔石墨碳有四种再生的方法，具体选用哪一种方法取决于被分析物和所用的溶剂。 酸/碱再生 适合于使用水性流动相分析离子类分析物。 1.将色谱柱倒装； 2.用50mL 含0.1%三氟乙酸的四氢呋喃／0.1水(1:1)溶液冲冼； 3.用50mL 含0.1%三乙胺或氢氧化钠的四氢呋喃／水(1:1)溶液冲冼； 4.用50mL

色谱柱清冼

氢离子型

用25℃的0.1 的H 2SO 4溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4～16h 。 用25℃的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h 。

用65℃的20/80的ACN/0.01MH2SO4溶溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h 。 钙离子埋 用85℃ 0.1mol?L pH6. 的Ca(NO3) 2溶液以0.1mL/mif的 量反 冲冼4～16h 。 用85℃ 0.1mol?L pH6. 的Ca(NO3) 2溶液以0.1mL/mif的 量反 冲冼4～16h 。

钠离 型

用25℃的20/80的乙

腈/水溶涺以0/1mL/man的流量反向冲冼4h 。

甈25℃的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向冲䆼th 。

用85℃的0.1mol/L!pH6.3的Ca(NO3-2溶澲以0.1mL/min的流量反向冲冼4～16h 。 用85℃的pH 5.3的0.1M Pb(NO3) 2溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4～16h 。

用25℃的20/ĸ0的乙腈/水溶液䫥0.1mL/min的流量反向冲冼4h 。 用25℃的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h 。

用25℃的2‰/80的乙腈/氶溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h 。 用25℃的20/80的乙腈/水溶液以0.1mL/min的流量反向冲冼4h 。

铅离子型

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GC 方法选择和优化

下图所示为GC 方法建立和优化的通用步骤。其它在本产品目录中与之有关信息的页码均在图中标示出来。

材料安全数据表(MSDS)。同时，还需将所有的电器都关机并拔下其电源插头。带好护目镜。 以下是GC 实验中的常见问题、可能的原因及相应的解决方法。 现象 基线相关问题 基线漂移

固定相积聚。

除去色谱柱末端部分。

原因 解决方法

载气瓶压力太低，不易控制。 载气或燃烧气流量波动。 色谱柱污染。

基线下漂

系统载气泄漏。 色谱柱未老化好。

基线从一个较高的初始值慢慢下漂。

在实验过程中，冲洗阀一直处于关闭状态。 冲洗流速太低。 冲洗阀关闭时间过长。 溶剂峰拖尾。

前过滤器污染

(当使用四极杆质谱检测器时)

基线上漂

色谱柱内杂质堆积。 检测器污染。 GC 柱泄漏。 空气进入系统之中。

温度程序控制下的基线上漂。

色谱柱污染。

更换气瓶，增加压力。 检查气阀。

检查气体的纯度，使用相应纯度的气体。

做泄漏测试，检查载气线路中的连接件是否拧紧。 延长色谱柱的平衡时间。 改变GC 程序。具体方法参见仪器使用说明。 增加冲洗流速。 缩短冲洗时间。

增强溶剂抑制，缩短冲洗时间。 联系服务代表。

检查气体的纯度，使用相应纯度的气体。

检查检测器，并清洗之。 检修色谱柱，更换色谱柱。 查找并修补泄漏点。 检修色谱柱。 降低载气流速。 检修色谱柱。

更换气瓶，替换气体过滤器。 检查柱温，确保其不超过色谱柱的最高使用温度；修理色谱柱；更换色谱柱。

检查并确保所有的连接件及螺丝等都处于拧紧的状态。 检测器退火。清洗检测器。 降低色谱柱的使用温度。色谱柱退火。

更换一支耐温更高的色谱柱。 在气路上安装氧气过滤器。检查气体系统及入口是否有泄漏。使用氧气含量低的气体。

将检测器与其它电子仪器隔离开。如果噪声消失，清洗检测器。 检查检测器的气体流速。 检修色谱柱。

检查气体纯度，安装相应的过滤器。

基线稳定在高示值。 载气流速太快。

色谱柱污染 气体污染。 色谱柱固定液流失。

连接件未拧紧。

基线形状不规则：溶剂出峰后开始下降

检测器污染。

基线不形规则：S 形 程序升温过程中色谱柱泄漏。

氧气污染导致固定相分解。

基线高频噪声 检测器污染。

燃烧气流速太低或者太高。 色谱柱污染。 检测器气源污染。

检测器温度高于色谱柱的最高使用温度。 色谱柱接头松动。

基线出现尖峰

将检测器温度下调至色谱柱的最高使用温度。 拧紧接头。

色谱柱离火焰太近(使用FID 时) 。 将色谱柱调整到合适的位置(喷

嘴末端下2-3mm) 喷嘴或检测器污染。

将检测器与其它电子仪器隔离开。如果尖峰消失，清洗喷嘴和收集器。

将FID 的温度至少调高到150℃。 降低流量至微高于最佳值。 增加流量至微高于最佳值。 将流量增加至40-50mL/min。 在最佳流速下测试色谱柱。 清洗并更换衬垫。 从柱中除去最后两卷。

将检测器温度上调至色谱柱最高使用压力下5℃。

降低样品的进样量或者进样浓度。

进样快速连贯。 快速进样。

减小进样量；降低分析物的浓度；增加分流比。 提高柱温。

使用一支膜厚更大的色谱柱。 反复练习，提高进样技术。 更换气瓶，更换过滤器。 清洗玻璃器皿，确保所使用的玻璃器皿干净，不会造成污染。 降低进样口温度。采用柱上进样技术。

样品进样前需进行充分的预处理。

卸下色谱柱，bake out入口。使用高质量的隔膜。更换分流出口过滤器。在气动装置和入口之间安装在线过滤器。

提高柱温箱最后的程序温度或总运行时间。增加柱流量。 提高初始柱温，减小进样体积(OC)。

安装一个保留缝隙(OC)。

若使用FID ，其温度太低。

谱峰相关问题 谱峰展宽

柱流量太快。 柱流量太低。

分流进样时，分流流量太低。 柱效降低。 进样器污染。 固定相积聚在出口。 检测器温度太低。 样品过载。

出现双峰 前伸峰

进样速度太慢。

错误的自动进样速度或模式。 柱或检测器过载。 柱温太低 固定相量太少。 进样技术欠佳。

鬼峰

载气被污染。

由玻璃器皿造成的污染。 已进样的样品分解 样品溶液污染

宽的鬼峰

入口或气动装置污染。

不规则椅装峰

前次实验的样品未完全洗脱下来。

色谱柱溶剂溢出。

溶剂峰后未见有谱峰

载气流速太快。 燃烧气流量错误。 检测器污染。

FID 火焰被溶剂峰淹没。 进样量过大。

S/SL进样器上，色谱柱位置错误(太高) 。

降低载气流速。 检查燃烧气的流量。 Bake out或清洗检测器。 检查检测器温度。 减小进样量。 检查色谱柱的位置。 更换或修理进样针。 检查色谱柱及连接。 更换电压计，更换放大器。 更换记录仪。 重新点燃。 检查电缆连接。 检查色谱柱的位置。

进样标准品混合物，测试色谱柱。 提高柱温。

不要超过固定相的最高建议使用温度。

清洗或更换衬垫。

用硅烷化过的纤维及干净的入口衬垫替换。 提高入口温度。 重置色谱柱入口接头。

根据色谱柱生产厂商提供的文献资料重新选择色谱柱。 重新安装色谱柱。 降低初始柱温。

检查并调整隔膜净化装置及出口流量。 减小进样量。 降低载气流速。 更换色谱柱。 降低柱温箱温度。 更换一支更长的色谱柱。 更换一支适合的色谱柱。 选择正确的进样技术。 检修或更换色谱柱。 更换隔膜。

弃去样品。将样品直立存于冰箱中。

使用一面有Teflon TM 的隔膜，将Teflon 面朝下(即朝向样品) 。

进样后不出峰 进样针阻塞。 色谱柱破裂或未连接。 电压计或放大器故障。 记录仪故障。 FID 火焰熄灭。

电子连接件损坏或丢失。 S/SL进样器上，色谱柱位置错误(太高) 。

样品峰拖尾 色谱柱降解。 柱温太低。

衬垫污染。

玻璃纤维或入口衬垫引起。 入口温度太低。 柱接头堵塞或连接不好。 固定相选择错误。

溶剂峰拖尾

色谱柱在进样口端位置不正确。 初始柱温太高。(柱上)

隔膜净化流量太小，分流出口流量太低。 进样量过大。

峰分不开

载气流速太高。 柱损坏。 柱温太高。 色谱柱过短。 色谱柱选择错误。 不恰当的进样技术。

不连续、高相应值的污染物峰

从GC 柱中流出 从隔膜流出 样品环隔膜污染样品

结果相关问题 峰面积重复性差

样品浓度与检测系统的动态范围不相容。

不恰当的进样技术。 不适合的进样参数。 非重复性的样品进样技术。

确保样品浓度适合检测系统。 尝试使用不同的进样技术。 检查进样温度。检查流速。 评价样品制备结果。

将实验结果与标准进样结果相比较。

定期检查并更换进样针。 定期检查并更换衬垫。 检查柱接头，启动泄漏检查。 精确计算进样量。使用一支干净、高质量进样针。

监测流量。更换在线过滤器。 提高载气流速，查找并除去气路中可能存在的阻塞。检查进样器/柱密封圈。

调整柱温箱或进样器参数。 启动泄漏测试，并修理之。 更换进样针或活塞密封。 提高进样器的温度。 检修色谱柱，更换色谱柱。 使用不含氧气和水的载气。 降低色谱柱温度。 检查隔膜和柱接头。 更换气瓶。

监测柱压或流量。如果需要检查并更换控制器。 进样后开始新一轮

减小进样量和/或进样体积。 检查柱温箱门和散热器。监测色谱柱温。

检修色谱柱，更换色谱柱。 增加平衡时间。

用更好的进样技术重复实验。 减小程序升温梯度。 监测并修理之。

进样针或衬垫泄漏。 进样泄漏。 进样技术差。 分流控制问题。

随着保留时间增加，载气流速太低。 灵敏度降低。 正常保留时间下灵敏度降低。

柱温箱或进样器参数未达最佳。 GC 气路泄漏。

进样过程中，进样针泄漏。 分流进样温度太低。

色谱柱柱效低，或者色谱柱类型选择有误。

保留时间减少

氧气和/或水造成色谱柱性能下降。

由于色谱柱bleeding 造成固定相流失

保留时间增加 保留时间重复性差

载气泄漏加剧。 载气用完。

气体控制器不稳定或漂移。 进样技术差。 进样量过大。 柱温不稳定

保留时间多变

GC 柱破损。 GC 平衡时间不够。 进样不佳。 程序升温太快。

空气从进样器密封处或载气管路中泄漏进系统。

更多有关特殊检测系统信息，请联系我们索取故障排查指南。

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调整保留时间(tR ´)

分析物的保留时间(tR ) 与死时间(tm ) 的差值。 t R ´= tR - tm

调整保留时间也等于分析物在固定相上的停留时间。

容量因子(k)

容量因子表示分析物与不保留样品的出峰时间比值，其中，t R 表示样品的保留时间，t m 表示不保留样品的出峰时间。容量的测定可帮助确定保留的变化是由色谱柱(容量因子随保留时间的变化而改变) 还是系统(容量因子不随保留时间的变化而改变) 引起。 k= (tR - tm )/ tm

容量因子越大，保留时间越长。

柱效(N)

见理论塔板数。

色谱柱评价

在Thermo GC 仪器上进行的应用，可测定色谱柱对流量的阻力，精确控制气体流量以确保一致的保留时间。

检测器

见ECD 、FID 、FPD 、NPD 、PID 及TCD 。

分配常数

溶质在固定相与流动相的浓度比例。

有效理论板数(Neff )

柱效的测试说明不保留洗脱时间的影响，t R ´是指调整保留时间而s 是指谱峰的标准偏差。 N eff ＝(tR ´/σ) 2

这一值保持稳定，不受使用的保留gaps 和guards 。基于峰宽计算的方法，