转基因作物pat蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法研究

　　1引言 　　pat基因（Hosphinothricin acethl transferase）由菌株S. viridochromogenes中分离得到，其Bg/11SsⅡ片段编码pat蛋白，通过使乙酰辅酶A与草丁膦游离的氨基结合，形成ACpat复合物，从而使草丁膦失去活性[1]。pat基因编码表达产物pat蛋白分子量约为23 kDa， 为同源二聚体，由183个氨基酸组成[2]，属于乙酰转移酶家族，与乙酰转移酶类具有相对相同的结构和功能[3]。pat蛋白无直接毒性，与已知的毒蛋白无同源性，也不具过敏原的特性，如热或消化稳定性、无糖基化位点等，且在植物中的表达量极低[3]，因此该基因片段也被作为一般转基因作物的标记基因。 　　转基因作物及其产品的检测方法主要有基于核酸水平的检测方法和基于蛋白质水平的免疫学检测方法[4]。核酸检测方法通过检测插入的外源基因，以聚合酶链式反应（PCR）为主[5，6]，包括巢式PCR[7]、多重PCR[8]、竞争性定量PCR[9]、实时定量PCR[10]、和基因芯片[11]等多种检测技术手段。蛋白质水平检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）[12，13]和免疫检测试纸条法（Lateralflow）[4]等。免疫检测试纸条操作简便、快速，但ELISA检测方法操作简单、灵敏度高，适合高通量检测，可用于转基因外源蛋白的定量检测。许文涛等[13]利用所纯化的pat蛋白制备得到了抗pat兔多克隆抗体，建立了pat蛋白的检测方法并对转基因和非转基因油菜进行了鉴别，该方法的检出限为20 μg/L。本研究利用所制备的抗pat蛋白鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体，建立了pat蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法，方法灵敏度高，可用于转基因作物中pat蛋白的定性和定量检测。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　PCR扩增仪（美国BioRad公司）；琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一仪器公司）；摇床及电热恒温培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；Wellwash 4 MK自动洗板机（芬兰Thermo公司）；Centrifuge 5810 R离心机（德国Eppendorf公司）；96孔酶标板（美国Costar公司）。 　　克隆载体pGEMT MD18（Promega公司）、pEASYBlunt（TransGen Biotech公司）； 克隆质粒WLBC9转基因质粒（本实验室保存）；大肠杆菌（E.Coli）菌株DH5α（T公司），原核表达菌株BL21（TIANGEN公司）；Taq DNA聚合酶（TIANGEN公司）； 硅胶模型TMPCR产物纯化试剂盒（赛百盛公司和TIANGEN公司）；T4连接酶、LATaq酶、EcoR1酶、Not1酶、HindⅢ（美国NEB公司）；Ampicillin（Amp）、Kanamycin（Kan）（美国Sigma公司）；PCR扩增引物（北京奥科生物技术有限责任公司）；蛋白纯化试剂盒、原核表达Overnight Express TB培养基（德国Merck公司）。 　　辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（IgGHRP）、牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、二甲基亚砜（DMSO）和TMB显色液均购自美同Sigma 公司；HRPDAB底物显色试剂盒购于TIANGEN公司，甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific 公司）；鼠抗体亚型ELISA鉴定试剂盒（美国Pierce公司），其它化学试剂均为分析纯（北京化学试剂公司）。 　　包被液、洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液等免疫检测缓冲液配方参考文献[14]。 　　2.2实验材料 　　转基因抗虫棉和非转基因棉花材料由河间市国欣农村技术服务总会提供。 　　6-7周龄Bal b/c雌性小鼠、新西兰长耳兔（军事医学科学院实验动物中心）；SP 2/0骨髓瘤细胞（中国兽药监察所）。 　　2.3实验方法 　　2.3.1pat基因的克隆、重组质粒构建 　　根据已知序列信息和NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）公布序列信息显示，pat基因包括原始序列（Sequence）及经过人工改造后的合成序列（Sequence）。对这两种基因及pat基因进行序列分析，并在实验室保存的转基因质粒WLBC9未知转基因构建质粒全序列的情况下，根据两种序列公布信息，分别利用Primer 5软件设计相应的PCR扩增引物序列，筛选并克隆目标基因片段。回收并连接测序载体pMD18 Simple Tvector，测序鉴定，于NCBI进行Blast比对后，将测序正确的质粒与原核表达载体pET30a（+）同时用限制性内切酶EcoR1和HindⅢ双酶切。用连接酶连接双酶切后的目标基因片段与原核表达载体pET30a（+）片段，构建pat蛋白的原核表达载体，质粒经二次酶切测序比对验证，完成pat蛋白重组质粒RP14的构建。 　　2.3.2pat蛋白在大肠杆菌中的原核表达与纯化 　　重组质粒RP14经质粒PCR和双酶切鉴定，取菌斑于普通LB培养基诱导培养两个阶段后，转化BL21菌株，转入Overnight expressTB 培养基中过夜培养后，10000 g离心后经吹打沉淀，分离上清液及沉淀（包涵体），分别取适当量经过SDSPAGE电泳，确定蛋白片段大小正确后，取上清液经Merck公司His Bind蛋白亲和纯化试剂盒进行过柱洗脱纯化并收集，冷冻干燥， 　　Symbolm@@ 40 ℃保存备用。 　　2.3.3动物免疫Bal b/c雌性小鼠免疫： 0.01 mol/L PBS将pat蛋白稀释成1.0 g/L，初次免疫用完全弗氏佐剂与等体积的免疫原混合，充分乳化，免疫5只小鼠，每只小鼠免疫剂量为200 μL。加强免疫用不完全弗氏佐剂乳化。免疫部位为腹腔或背部皮下。经过5次免疫后，对小鼠血清进行检测。 　　新西兰长耳兔免疫： 0.01 mol/L PBS将pat蛋白稀释成2.0 g/L，初次免疫用完全弗氏佐剂与等体积的免疫原混合，充分乳化，免疫2只新西兰长耳兔，每只兔子免疫剂量为1.0 mL，免疫部位为后足掌垫处。加强免疫用不完全弗氏佐剂乳化。每只兔子注射1.0 mL，免疫方式为背部皮下多点注射。经过3次免疫后，对兔血清进行检测，达要求后立即放血收集多克隆抗体。 　　2.3.4血清效价测定小鼠经过第5次免疫后第6天，用毛细玻璃管从眼眶取少量血液，室温静置1 h，4 ℃过夜，4000 r/min离心10 min，收集血清，4 ℃保存。血清效价的测定采用间接ELISA方法[14]。效价定义为OD值为1.0时的抗血清最大稀释倍数。新西兰长耳兔血清效价测定同小鼠血清效价测定。 　　2.3.5单克隆抗体的制备、抗体纯化和鉴定 　　单克隆抗体的制备和纯化同参考文献[15]。 　　抗体效价：间接ELISA方法测定抗体的效价[14]。单克隆抗体类型鉴定：鼠抗体亚型ELISA鉴定试剂盒检测。抗体特异性：Western Blot和交叉反应率表示抗体的特异性。 　　2.3.6兔多克隆抗体的制备与纯化将收集血液转移至玻璃培养皿中，室温下以不高于水平面30°斜角静置，收集析出血清。离心取上清液，采用饱和硫酸铵法进行纯化，蒸馏水内透析后冻干，于 　　Symbolm@@ 40 ℃冰箱保存。 　　2.3.7双抗夹心ELISA的建立兔多抗用包被缓冲液稀释至工作浓度，37 ℃温育3 h，弃包被液，洗液洗板4次；将100 μL不同浓度（0， 1.56， 3.13， 6.25， 12.5， 25， 50和100 μg/L）的pat蛋白液加入酶标板，每个浓度重复3次， 37 ℃温育0.5 h，洗板4次； 加入100 μL稀释至工作浓度的单抗溶液，37 ℃ 温育0.5 h，洗板4次。洗板后加入1000倍稀释的酶标羊抗鼠抗体，置于37℃温育0.5 h，洗板4次； 每孔加入100 μL底物缓冲液，避光显色10 min后，每孔加50 μL终止液于450 nm波长下测各孔OD值。以纯化蛋白浓度的自然对数为横坐标，OD值的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线。 　　2.3.8pat蛋白检测称棉花叶片样品1.0 g，加5 mL PBS研磨后4 ℃静止提取4 h， 3000 r/min离心取上清液。将上清液冷冻干燥后，以1 mL 蒸馏水溶解，取100 μL上清液，用于pat蛋白含量测定。检测方法同2.3.7节。 　　3结果与讨论 　　3.1pat蛋白的表达、纯化及免疫原的制备 　　3.1.1pat蛋白的表达根据已知序列信息和网站公布序列信息显示，pat基因有原始序列（Native sequence）及经过人工改造后的合成序列（Ynthetic sequence）。对这两种基因及bar基因进行序列分析，并在实验室保存的转基因质粒WLBC9未知转基因构建质粒全序列的情况下，根据两种序列公布信息，分别利用Primer 5软件设计相应的PCR扩增引物序列。经过引物配对扩增验证，质粒中所含有pat序列为人工合成序列，序列如下： 　　扩出条带为pat基因的目的条带，约550 bp。回收并连接测序载体pMD18 Simple Tvector，测序鉴定比对，得到正确表达的质粒。将测序正确质粒与原核表达载体pET30a（+）同时用限制性内切酶EcoR1和Not1双酶切，构建pat蛋白的原核表达载体，质粒经二次酶切测序比对验证，完成pat蛋白重组质粒RP14的构建，重组质粒RP14经质粒PCR及再次双酶切鉴定，挑取菌斑经大肠杆菌E.Coli在普通LB培养基诱导培养两个阶段后，转化BL21菌株，转入OvernightexpressTB 培养基中过夜培养后，10000 g离心后经吹打沉淀，分离上清液及沉淀（包涵体），上清液和沉淀分别经过SDSPAGE电泳分析，确定蛋白片段大小（-31 KDa， 含标签蛋白），发现该蛋白在上清液和包涵体中均有表达，但上清 　　3.1.2pat蛋白纯化及免疫原的制备取上清液利用Merck公司HisBind蛋白亲和纯化试剂盒进行过柱洗脱纯化（图2）。收集洗脱蛋白液进行透析、冻干、二次溶解及超滤浓缩，利用BAC蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，冷冻干燥， 　　3.2单克隆抗体的制备 　　融合前4天对小鼠血清进行效价与抑制率检测。选取血清效价高（>8000）的小鼠进行加强免疫，取加强免疫后的小鼠脾细胞与SP 2/0 骨髓瘤细胞进行融合，[TS（][HT5”SS]图3pat蛋白Western Blot免疫印迹分析（A：蛋白Marker； B， C和D：pat蛋白） 　　Fig.3Western Blot of pat protein （A： protein marker； B&C&D： pat protein）[HT5][TS）]融合率约为92% 。间接ELISA法检测细胞上清液，选择吸光值大于1.0的阳性孔用有限稀释法进行多次克隆，筛选到一株效价与特异性均较好的单克隆细胞株，命名为2F6。将该细胞株扩大培养，制备腹水并用饱和硫酸铵法纯化抗体。冷冻干燥， 　　Symbolm@@ 40 ℃保存。用时取部分抗体用0.01 mol/L PBS稀释成1 g/L备用。 　　3.3单克隆抗体的性质鉴定 　　3.3.1单克隆抗体效价检测间接ELISA法检测抗pat蛋白单克隆抗体2F6的效价，以未免疫的小鼠血清作为阴性对照，测得抗pat蛋白单克隆抗体2F6的效价约为5×104。 　　3.3.2单克隆抗类型检测利用Pierce公司的单抗类型检测试剂盒对单抗2F6的类型进行检测（见表1）。结果表明：2F6与IgG1类和κ的吸光值分别是1.029和0.881，与其类型的IgG， IgA， IgM和λ几乎没有反应。因此，抗pat蛋白单克隆抗体2F6为IgG1类，轻链为κ型。 　　交叉反应率：ELISA法检测抗pat蛋白单克隆抗体2F6的特异性，转基因外源蛋白Bt Cry1Ac， Bt Cry2A， EPSPS和CpTI的抗原浓度为2 μg/mL时，其OD值和阴性对照相当，表明抗pat蛋白单克隆抗体2F6与Bt Cry1Ac， Bt Cry2A， EPSPS和CpTI等外源蛋白不存在交叉反应。 　　3.4多克隆抗体制备与纯化 　　经检测兔血清效价>10000，将收集的兔血清用饱和硫酸铵法纯化，冷冻干燥， 　　Symbolm@@ 40 ℃保存。用时取部分抗体用0.01 mol/L PBS稀释成1 g/L备用。 　　3.5ELISA工作曲线 　　棋盘格验筛选最佳包被兔多克隆抗体、鼠单克隆抗体的工作浓度。确定pat蛋白双抗夹心ELISA工作条件为：包被兔多克隆抗体1/2000，鼠单克隆抗体1/8000，HRP标记羊抗鼠IgG 1/1000。建立标准曲线如图4，线性回归方程为y=0.6914x-2.572，相关系数R2=0.9951，检测范围为1.6-100 μg/L。 　　3.6转基因棉中pat蛋白含量测定 　　中pat蛋白的含量，结果见表2。在5个转基因抗虫棉品种中，只有3个检测到pat蛋白； 而2个非转基因棉花品种叶片中未检出pat蛋白。2个抗虫棉品种叶片中未检出pat蛋白可能是由于该品种中未用pat标记基因。 　　本研究通过质粒构建、基因克隆和原核表达，成功表达pat蛋白，利用所制备的抗pat蛋白的鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体，建立了可检测pat蛋白的SandwichELISA方法。单抗效价为5×104；单抗为IgG1类，轻链为κ型；检测范围为1.56-100 μg/L。本研究所建立的SandwichELISA方法与文献[13]中报道的直接包被pat标准蛋白或提取液，再加入抗pat兔多克隆抗体所建立的ELISA检测方法相比具有更好的灵敏度、稳定性和特异性， 也避免了直接包被提取物易受样品中油脂等干扰物影响的缺点。利用本研究所建立的ELISA方法测定了5个转基因抗虫棉和2个非转基因棉花叶片中的pat含量，其中转基因抗虫棉中的3个品种检测出pat蛋白，其余均未检出pat蛋白。本研究所建立的检测方法具有灵敏、快速、准确等特点，可以用于检测转基因作物中的pat蛋白。 　　References 　　1Thompson C J， Movva N R， Tizard R， Crameri R， Davies J E， Lauwereys M， Botterman J. Embo J.， 1987， 6（9）： 2519-2523 　　2Wehrmann A， Van Vliet A， Opsomer C， Botterman J， Schulz A. Nat. Biotechnol.， 1996， 14（10）： 1274-1278 　　3Herouet C， Esdaile D J， Mallyon B A， Debruyne E， Schulz A， Currier T， Hendrickx K， van der Klis R， Rouan D. Regul. Toxicol. Pharm.， 2005， 41（2）： 134-149 　　4Ahmed F E. Trends Biotechnol.， 2002， 20（5）： 215-223 　　5Anklam E， Gadani F， Heinze P， Pijnenburg H， Van Den Eede G. Eur. Food Res. Technol.， 2002， 214（1）： 3-26 　　6Meyer R. Food Control， 1999， 10（6）： 391-399 　　7Zimmermann A， Hemmer W， Liniger M， Lüthy J， Pauli U. LWTFood Science and Technology， 1998， 31（7）： 664-667 　　8Tao Z， Cai X F， Yang S L， Gong Y. Plant Mol. Biol. Rep.， 2001， 19（4）： 289-298 　　9Studer E， Rhyner C， Lüthy J， Hübner P. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung undForschung A， 1998， 207（3）： 207-213 　　10Wurz A， Bluth A， Zeltz P， Pfeifer C， Willmund R. Food Control， 1999， 10（6）： 385-389 　　11Feriotto G， Borgatti M， Mischiati C， Bianchi N， Gambari R. J. Agr. Food Chem.， 2002， 50（5）： 955-962 　　12Lipp M， Anklam E， Stave J W. J. Aoac Int.， 2000， 83（4）： 919-927 　　13XU WenTao， HUANG KunLun， DENG AiKe， LUO YunBo. Chinese J. Agr. Biotechnol.， 2006， 3（3）： 177-182 　　许文涛， 黄昆仑， 邓爱科， 罗云波. 农业生物技术学报， 2006， 3（3）： 177-182 　　14Zhao J， Li G， Wang B ， Liu W， Nan T ， Zhai Z， Li Z ， Li Q . Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 386（6）： 1735-1740 　　15NAN TieGui， HE SuPing， TAN GuiYu， LI Gang， WANG BaoMin， HUANG LuQi. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（8）： 1206-1210 　　南铁贵， 何素平， 谭桂玉， 李 刚， 王保民， 黄璐琦. 分析化学， 2010， 38（8）： 1206-1210 　　16YANG YunYun， MOU DeHai， TONG ChaoYang， MU XiHui， HAO LanQun. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（3）： 439-442 　　杨运云， 牟德海， 童朝阳， 穆唏惠， 郝兰群. 分析化学， 2007， 35（3）： 439-442