眼针对局灶脑缺血再灌注损伤保护机制研究

　　3.沈阳市中医院，辽宁 沈阳 110003） 　　摘 要：目的：探讨眼针疗法治疗缺血脑血管病的可能机制。方法：采用随机分组将大鼠分为假手术组、模型组与眼针组，改良的线栓方法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型；取上焦区、下焦区、肝区、肾区为施加因素；采用神经功能缺损评分，TUNEL法检测细胞凋亡。结果：眼针组与模型组比较神经功能缺损评分统计学差异（P　　关键词：缺血再灌注；梗死体积；神经功能缺损评分；眼针疗法 　　中图分类号：R743.31 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0735-03 　　Abstract:Objective: The subject is to probe the possible mechanism of eye-acupuncture in the treatment of Ischemic Cerebrovascular Disease.Method: Divided the rats into 3 groups by random, that is, the sham-operated group, model group and eye-acupuncture group，Make the model rat of focal cerebral ischemia-reperfusion according to the improved method；to take on the Shangjiao area, Xiajiao area, liver area, kidney area for the imposition factors ；Make the scores of neurological function deficits ，detect neuronal apoptosis by the TUNEL method；Results: eye-acupuncture group compared with model group are significantly different （P　　Key words:ischemia-reperfusion infarct volume scores of neurological function deficit the therapy of eye-acupuncture 　　缺血再灌注损伤的病理机制十分复杂，而目前认为缺血半暗带区神经元死亡的主要形式是凋亡【sup】［1］【/sup】。细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡,即程序性细胞死亡（PCD）,具有主动性、选择性、可逆性的特点【sup】［2］【/sup】。眼针疗法治疗脑血管病经过30余年的临床实践，疗效肯定，本项实验研究从细胞凋亡途径进一步探讨其作用机制，为临床治疗提供科学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物分组 　　选择健康雄性SD大鼠90只，由中国医科大学实验动物中心提供。体重（260±20）g，随机分为假手术组、眼针组与造模组，每组再分为3h，24h，72h时间点3个亚组。 　　1.2 试剂及仪器 　　细胞凋亡检测（TUNEL法）试剂盒， DAB显色试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。倒置荧光显微镜，OLYMPUS BX50。切片机，德国LEICA：RM2135。计算机图像分析仪，北京航空大学图像中心。 　　1.3 模型制作方法 　　1.3.1 模型制作栓线的处理 取3.0号钓鱼用尼龙丝线剪成长45mm的栓线，将头端火焰烧成光滑球面直径为0.25～0.28 mm ,距球面30mm处用修正液做标记，酒精消毒后置生理盐水中备用。 　　1.3.2 模型制作 参照 Longa【sup】［3］【/sup】改良的线栓方法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，术前禁食12h,不禁水，10%水合氯醛 （330mg/kg ）腹腔麻醉 ,消毒颈部皮肤 ,沿颈中线偏右做一长度约1cm的切口 ,仔细分离暴露出右侧颈总动（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。结扎颈总动脉及颈外动脉根部,在右侧颈总动脉分叉处以眼科剪剪一“V”形小口 ,将尼龙线从小口缓慢插入 ,经颈总动脉分叉处进入右侧颈内动脉入颅 ,继续轻柔推进，当感到有一定阻力时即停止推送，此时栓线进入深度 1.8～2.0cm，栓线头端正好位于大脑中动脉起始部位，阻断血流。如栓线进入深度 1.0 cm就感阻力,可缓慢退出,调整进线方向靠近颈内动脉侧再缓慢进入。结扎近端备线，防止栓线松动。可见大鼠右眼虹膜颜色变浅，出现右侧Homer【sup】,【/sup】s征。手术条件控制:术中及术后保持室温25℃左右，60 W的白炽灯照射动物以维持其肛温在（37.5±0.3）℃。栓塞 2h后 ,再次麻醉,头位固定,缓慢轻柔拔出1.0cm尼龙线进行再灌注。将造模成功的大鼠经神经功能缺损评分，均衡分到模型组与眼针组。假手术组插线深度1.0cm，其他同模型组。 　　1.3.3 动物模型的评价 参照Longa 5分【sup】［3］【/sup】制评分标准:0分为无症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向对侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。1～3分纳入实验。假手术组在清醒及随后的时间未见明显神经功能缺损症状和体征，术后动物进食及活动恢复良好。 　　1.4 实验方法 　　1.4.1 大鼠眼穴定位方法 参照彭静山教授著《眼针疗法》【sup】［4］【/sup】，记载人体的眼穴划分方法。 　　取穴：上焦区、下焦区、肝区、肾区。 　　刺法：用0.25mm×13mm毫针在相应眼穴区距眶内缘2mm处，平刺，由该区始点向该区终点方向，刺入0.3cm，行捻转手法，留针30min，15 min时行针1次，时间1min。 　　1.4.2 针刺时机 再灌注即刻对动物神经功能缺损评分，眼针组在缺血再灌注即刻及每隔12h、处死前30min进行眼针治疗。 　　1.5 神经功能缺损症状评分 　　参照Longa 5分制【sup】［3］【/sup】评分标准行神经功能缺损评分。

　　1.6 标本制作 　　各组大鼠根据不同时间灌注固定取脑。重新测大鼠体重，10%水合氯醛 （600mg/kg ）腹腔注射深度麻醉后，将鼠仰卧固定于大鼠固定架上，提起剑突下缘上腹部皮肤，纵行剪开胸前部皮肤直至锁骨上窝，提起剑突沿胸骨前壁剪开膈肌，沿胸骨旁线剪开前胸壁固定，剪开心包暴露心脏。从心尖部沿左心室插入灌注管至升主动脉入口，剪开右心耳，先用0.9%生理盐水150mL快速冲洗组织内血液，将大鼠体内血液置换干净（从右心房流出液体由血性转为清澈），再用4%多聚甲醛固定液快速灌注100mL，再缓慢灌注100mL,直至鼠尾巴翘起，身体逐渐僵硬，颜色变白为止。灌注固定完成后，迅速断头取脑。轻轻打开颅腔，暴露出大鼠脑组织。用眼科剪轻轻将与脑组织相连的硬脑膜剥离，切断延髓取出右侧脑组织。弃去嗅球、小脑和低位脑干，取材范围包括梗死区及其周围的脑组织，用生理盐水冲洗，自额极至中脑间（距额极7-11mm）脑组织，入4℃4%多聚甲醛固定液中固定过夜，进行常规脱水、透明、石蜡包埋，连续冠状切片。 　　1.7 细胞凋亡检测（TUNEL法） 　　1.7.1 实验步骤 常规脱蜡至水，把石蜡切片依次放入： 二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→90%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min→蒸馏水冲洗→滴3%H【sub】2【/sub】O【sub】2【/sub】室温10min→蒸馏水冲洗3次。取TBS1∶200新鲜稀释Proteinnasek 37℃，消化15min；TBS洗2min，3次。加标记缓冲液20ul/片（用TBS代替标记液作阴性对照），按每张切片去TdT和DIG-d-UTP各1微升，加入18微升标记缓冲液中，混匀后加入，置湿盒中，37℃，标记2h。TBS皮潦草2min，3次。加封闭液50μL/片，室温放置30min，甩掉封闭液，不洗。用抗体稀释液1∶100稀释生物素抗地高辛抗体，混匀后50μL加至切片上，置湿盒中，37℃，30min；TBS 2min，3次。用抗体稀释液1∶100稀释SABC,混匀后50μL加至切片上，置湿盒中，37℃反应30min；TBS2min，3次。DAB显色，镜下观察，水洗。苏木素轻度复染，TBS洗，蒸馏水洗，脱水封片。 　　1.7.2 细胞凋亡切片图像结果分析方法 采用数码医学图像分析系统，光镜下可见细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性表达，即凋亡的细胞。每组选8张切片，利用显微摄像系统，取每张切片中梗塞灶边缘区域相互不重叠的4个视野（×200）按照像素分布摄入图像并保存于病理图像分析系统内，选择凋亡分析模块，通过灰度调节，区分视野内凋亡细胞个数，计算凋亡细胞数，取平均值进行统计学分析，见图1。 　　1.8 统计学方法 　　所有实验数据以均值土标准差（±s）表示，所得数据用SPSS 10.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析。 　　2 结 果 　　2.1 神经功能缺损评分结果 　　假手术组大鼠手术完成后，无神经缺损体征出现，模型组、眼针组于再灌注即刻出现明显神经功能缺损症状，证明模型制作成功。模型组、眼针组神经功能缺损症状经统计学处理（P>0.05）。再灌注3h，眼针组与模型组两组间比较无统计学意义（P>0.05）；再灌注24h，神经功能缺损最严重，模型组眼针组与模型组两组间比较有极显著差异（P　　表1 各组神经功能缺损评分均数比较（±s） 　　注：与模型组比较，＃P>0.05；�P　　2.2 细胞凋亡检测结果 　　假手术组各时间点仅见少量凋亡细胞。模型组及眼针组凋亡细胞于脑缺血再灌注3h凋亡细胞开始增多。凋亡细胞主要分布于缺血周边区，即缺血半暗带内，为圆形或椭圆形，核膜结构完整，核内染色质浓聚，染色质边集于核周，呈新月形、环行、长条形、块状小体甚至形成核碎片，核内可见棕褐色的TUNEL反应产物。模型组及眼针组各时间点凋亡细胞与假手术组相比均有显著性差异（P　　图1 凋亡细胞表2 各组半暗区神经元凋亡数比较（±s） 　　注：与假手术组比较，＃P　　3 讨 论 　　眼针疗法是著名老中医彭静山教授于70年代首创，在眼眶周围用针刺等刺激防治疾病的一种微针疗法。其理论基础是眼通过经络系统与脏腑密切相连。根据眼针的取穴原则，针对中风的疾病基础是肝肾阴虚，取肝区、肾区滋补肝肾，上肢属上焦，下肢属下焦，因此取上焦区、下焦区通经活络，疏通上下肢经脉气血，使肢体经络气血通畅，经脉得养，半身不遂得以恢复。以往临床研究眼针治疗缺血性中风疗效肯定。以往研究提示眼针可激发脑细胞的功能活动，增加局部脑血流量【sup】［5］【/sup】。本研究通过动物实验从细胞凋亡途径探讨眼针治疗中风的机理。 　　神经功能缺损症状评分是评价缺血性脑损害最重要的终末指标之一，也是评价模型成功及脑组织功能恢复的有效方法。本实验除假手术组外，眼针组与模型组大鼠均于术后出现了神经功能缺损， 24h神经功能缺损最严重，分值最高，72h有所恢复，这说明大鼠脑缺血再灌注后在无治疗的情况下，自身存在神经功能恢复能力，但与眼针组比较，眼针组大鼠神经功能缺损症状明显恢复，24h、72h时间点与模型组比较均有显著性差异。这与眼针在临床上改善脑梗塞患者的肢体瘫痪程度，恢复肢体功能，相一致。 　　有效的抑制缺血后神经元凋亡是脑缺血治疗的关键。细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡,即程序性细胞死亡（PCD）,具有主动性、选择性、可逆性的特点【sup】［2］【/sup】。脑缺血后治疗的关键就在于及时挽救缺血周边区即半暗带区内尚未死亡的神经元，因此如何有效的拮抗脑缺血后神经元凋亡，挽救半暗带是治疗缺血性脑血管病的关键。我们的实验显示模型组在脑缺血再灌注3h缺血周边区内凋亡神经元开始出现，随时间延长在脑缺血24h后凋亡神经元数达到高峰，以后逐渐减少。眼针组与模型组比较，眼针组凋亡神经元数目均明显少于模型组，说明眼针能有效抑制脑缺血再灌注后神经元凋亡作用。这一结论与李成勇等【sup】［6］【/sup】研究的结果大致相同。笔者认为可能是眼针通过抑制缺血半暗区细胞凋亡，改善局部缺血缺氧从而改善缺血半暗区微循环，对脑缺血再灌注损伤起保护作用。 　　参考文献 　　［1］ Reed JC Jurgensmeier JM，Matsuyama S. Bcl-2 family proteins and mitochondrial ［J］.Biochim Biophsy Acta，1998，1366（1-2）:127-137. 　　［2］ Canese R, Fortuna S, Lorenzini P, et al. Transient global brain ischemia in young and aged rats: differences in severity and progression, but not localization,of lesions evaluated by magnetic resonance imaging［J］.MAGMA，1998,7（1）:28-34. 　　［3］ Longa EZ，Weinstein PR，Carison S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without carniectomy in rats［J］.Stroke,1989,20（1）:84-91. 　　［4］ 彭静山.眼针疗法［M］.沈阳：辽宁科技出版社,1991:31. 　　［5］ 海英，闫也，陈其维，等.眼针对脑梗死患者脑SPECT―rCBF的观察研究［J］.辽宁中医杂志，2007，34（10）：1459-1460. 　　［6］ 李成永.眼针对急性脑梗塞大鼠细胞凋亡及Bcl-2、Bax的影响［J］.上海针灸杂志，2004，22（2）：42.