实验六蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
实验六 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
一、目的
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一,承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础,也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质,提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法,简便快捷,灵敏度高,稳定性好,是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理,了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理
考马斯亮蓝G-250是一种染料,在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0~1000μg范围内,蛋白质一色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料
1.仪器
(1)分析天平
(2)具塞刻度试管 10ml× 8
(3)吸管 0.lml×I,lml×Z,5ml×I
(4)研钵
(5)漏斗
(6)离心管 10ml
(7)容量瓶 10ml
(8)离心机
(9)721型分光光度计
2.试剂
(1)标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100ml,制成 100 pg/ml的原液。
(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml 90%乙醇中,加入 85%(m/v)的磷酸 100ml,最后用蒸馏水定容到 1000ml。 此溶液在常温下可放置一个月。
3.材料
绿豆芽
四、操作步骤
1
盖上塞子,摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在 l h内完成)。以牛血清白蛋白含量(μg)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。
2.样品中蛋白质含量的测定
(1)准确称取约200mg绿豆芽下胚轴,放入研钵中,加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆,离心(4000r/min,10min),将上清液倒入10ml容量瓶,再向残渣中加入2ml蒸馏水,悬浮后再离心10min,合并上清液,定客至刻度。
(2)另取1支具塞试管,准确加入0.l ml样品提取液,再加入0.9 ml蒸馏水,5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后,以标准曲线1号试管做参比,在595 nm波长下比色,记录吸光度。
五、结果处理
根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg),按下式计算:
样品蛋白质含量(μg/g鲜重)=(查得的蛋白质含量(μg)×提取液总体积(ml))/(样品鲜重(g)×测定时取用提取液的体积(ml))
六、注意事项
比色应在出现蓝色2 min~l h内完成。
七、思考题
1.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么?还有哪些蛋白质定量法?
2.如何正确使用分光光度计?
参考文献
鲁子贤。蛋白质化学。北京:科学出版社,1981
文树基。基础生物化学实验指导。西安:陕西科学技术出版社,1994
张龙翔.生物化学实验技术。北京:人民教育出版社,1981