实验二愈伤组织的诱导与分化
实验二 愈伤组织的诱导与再分化
一、目的
掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程及再分化。
二、原理
以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。
三、实验材料
水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；
四、仪器设备及用具
（一） 仪器设备
超净工作台 培养室
（二） 用具（每组5人用量）
量筒：100ml×2
培养皿：￠9cm×1
三角瓶：50ml×2(无菌)，1000ml×1
枪形镊：×4
无菌滤纸：（10cm×10cm）×5
五、试剂及培养基
（一） 试剂
75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400ml)
(二) 培养基
1、诱导培养基：N6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l
2、分化培养基：N6+ CuSO4·5H2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l
六、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒
用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。
2、消毒剂的配制
（1）、75%酒精：每组配95ml。量取95%酒精75ml，加蒸馏水至95ml即可.
（2）、2%NaCLO：每组配100ml.
x：应吸取的NaCLO原液的毫升数；
y：NaCLO原液的有效氯浓度。
3、种子去壳
用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。每人准备30粒去壳种子。
4、外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行）
将米粒放入50ml无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO，用无菌水洗3次，每次停留10.5%×100 (ml)
分钟→倒去无菌水，种子放在带无菌滤纸的培养皿中吸干。
5、接种与观察
愈伤组织诱导
将吸干的种子接入培养基，注意使胚朝上。每瓶接10粒，每人2瓶。写上日期、接种人、放入培养室25℃暗培养。1周后调查计算污染率，2周后调查计算愈伤组织诱导率。
污染率(%)=
污染的种子数 100 接种的总种子数
形成愈伤组织的种子数
诱导率 (%)=
6、愈伤组织的再分化观察
在无菌条件下将诱导获得的愈伤组织（从约3周后安排此实验），从原材料中用镊子剥离后，接种到分化培养基中，每瓶接种4粒，每个同学接种3瓶，后置于光照条件下控制培养（25℃，2000lux每天光照10小时下培养），观察分化出苗的状况（一般需要2-3个星期的培养时间）。1个月后调查计算分化率。 接种的总种子数 100
分化植株的愈伤块数 分化率l00 接种的总块数
七、结果与分析
1． 如何降低污染率？
2． 愈伤组织的形成、愈伤组织再分化与哪些因素有关？