目的基因T载体克隆实验步骤
PCR产物的T载体克隆
实验原理
一. 重组质粒的构建:
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg
切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体,载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样,pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中,形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。 2 、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶
二. 感受态制备原理
细菌在0C CaCl2低渗溶液中胀成球形,丢失部分膜蛋白,成为容易吸收外源DNA的状态。
三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法(蓝白筛选)原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因,可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体,可催化乳糖的水解.用X-Gal为底物进行染色时,呈蓝色。 现在一些特定的质粒(比如pUC/pBS等),常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸(α肽段)的编码序列,在这个编码序列里还插入一个多克隆位点(MCS),它并不影响lacZ的表达。另外,常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列(β肽段),的编码序列。在各自独立的情况下,这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞,在培养基诱导物IPTG的诱导下,载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端(α肽段),这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列(β肽段)互补,形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后,会造成lacZ基因不能表达,从而不能合成β—半乳糖核苷酶;而对于空载体,lacZ基因正常表达,通过α互补合成β—半乳糖核苷酶,分解培养基里的色素底物X-gal,最终形成蓝色的化合物,出现蓝色菌斑。
X-Gal,中文名为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷,分子式为C14H15BrClNO6,分子量为408.63,它是β–半乳糖苷酶的底物,水解后呈蓝色。
IPTG,中文名, 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 ,分 子 式: C9H18O5S ,分 子 量 238.30 ,保存温度2-8°C冷藏保存 ,配制好后保存于-20°C,室温可放置一个月 。主要作用:异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用
实验准备
清洗,5个100ml锥形瓶(外加1个小的),6副培养皿,3个小试剂瓶,接种环,涂布棒 准备100ml超纯水
20mg/mlX-gal 1 ml, 200mg/ml IPTG 1 ml。
大肠杆菌菌液1ml
灭菌:5个100ml锥形瓶(外加1个小的),6副培养皿,3个小试剂瓶,接种环,涂布棒,10ml超纯水,LB培养基,1.5mlEP管,大小枪头,过滤用具2副,,0.1mol/L CaCl2
溶液:LB300ml(液体50ml+50ml,固体100ml),0.1mol/L CaCl2 10ml, 100mg/mlAmp 1 ml,
试剂
20mg/ml X-gal X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺(DMF)溶解X-gal配制成的20mg/ml(取0.02gX-gal,用DMF定容为1ml)的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中,装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏,并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。(DMF二甲基甲酰胺; Dimethylformamide; N,N-Dimethylformamide; DMF; CAS:68-12-2 理化性质:无色、淡的胺味的液体。分子式C3-H7-N-O。分子量73.10。相对密度0.9445(25℃)。熔点-61℃。沸点152.8℃。) 200mg/ml IPTG 在0.8ml蒸馏水中溶解0.2g IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤器过滤除菌,贮存于-20℃。
LB培养基: 配制每升培养基,应该在950 ml去离子水中加入:
胰化蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl 10g
摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.3.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.( 100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉为固体培养基) 0.1mol/LCaCl2:取0.11098g氯化钙固体定容至10ml
Amp(100mg/ml):溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中,最后定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌.
实验步骤
(一).目的基因片段与载体连接
器材
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面离心管架,台式离心机,干式恒温气浴。
试剂
T 载体,T4 DNA 连接酶,连接酶缓冲液,无菌dd Water
操作步骤
PCR产物与T载体直接连接:
(1) 事先将干式恒温仪(或冰盒里的水)温度设定在14~16C。
(2) 取4个灭菌的200ul微量离心管,加入:(需要调整)
4l 目的基因
1l T载体
0.5l T4 DNA连接酶(TAKARA, 350U/ul)后加
1l 连接酶缓冲液10 x buffer
3.5 l dd Water
总量 10l 体系
(3) 述混合液轻轻震荡后再短暂离心,然后置于14C干式恒温仪(或14C水中)
中保温过夜(12-16h)。
(4) 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。
(二). 大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化
器材
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,50ml 微量离心管,1.5ml 微量离心管,台式冷冻离心机,制冰机,恒温摇床,分光光度计,超净工作台,恒温培养箱,摇菌试管,三角烧瓶,接种环,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱,滤膜和过滤器
试剂
E. coli菌种,LB培养基,0.1 mol/L CaCl2溶液,无菌dd Water ,LB培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌dd water,IPTG,X-gal。
步骤
(1) 在超净工作台中,将1ml大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基(不含抗菌素),
37℃摇床培养过夜。
(2) 取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中,37℃下250r/min摇
床培养23h,测定OD590为0.35~0.4左右(
(3) 将1ml菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中,于冰上放置10min,然
后于4℃,5000rpm离心5min。
(4) 将离心管倒置以倒尽上清液,加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液,立即在涡旋
混合器上混匀,插入冰中放置30min。
(5) 4℃,5000rpm离心5min,弃上清液后,用100μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂
悬,插入冰中放置2h,可以直接用作转化实验,或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。
(6) 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
(7) 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100μL)感受态菌,立即用手指加温融化后插入
冰上,冰浴510min。
(8) 加入5μL连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng),轻轻震荡后放置冰上
20min。
(9) 轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3min。
(10) 在超净工作台中向上述各管中分别加入300μL LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,
然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。
(11) 在超净工作台中取上述转化混合液200μL,分别滴到含合适抗菌素(Amp 100ug/L)
的固体LB平板培养皿中,再在平板上滴加40μL 20mg/ml X-gal,7μL 200mg/ml IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:一个不含抗生素作为对照组,玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂,菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率。)。
(12) 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30min直到表面的液体都
渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
(13) 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面。
(14) 观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
(三). 转化克隆的筛选和鉴定
器材
旋涡混合器,小镊子,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,超净工作台,酒精灯,无菌牙签,摇菌管。
试剂
LB培养基(加抗菌素),PCR用试剂,引物,质粒提取用试剂,酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液,65%甘油(65%甘油,0.1mol/L MgSO4,0.025mol/L Tris Cl pH8.0)。 操作步骤
方法一:快速PCR筛选法
(1) 在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落,并用记号笔在其所在
的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
(2)在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。
dd water 16μl
10×PCR buffer(不含MgCl2) 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl(每种dNTP终浓度0.2mM)
10μmol/L Primer1 1μl(12.5—25pmoles)
10μmol/L primer2 1μl(12.5—25pmoles)
模板质粒 用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落,再伸入PCR混合液中洗一洗
Taq酶 0.5μl(1.5u)
总体积 25μl
(2)根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序(本实验室已经设置为WZ): ① 94℃ 5min
② 94℃ 1min
③ 60℃ 1min
④ 72℃ 1min50s
⑤ goto② 29 times
⑥ 72℃ 10min
(2) PCR结束后,取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳(与原始插入片断同时比对)。观
察胶上是否有预计的主要产物带。
(3) 按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒
(4) 提取到的质粒与原先的空载体(或已知分子量的质粒)再对比电泳,以进一步确
认。
方法二:提质粒再PCR或酶切鉴定
(1)在超净工作台中取3支无菌摇菌管,各加入3mL LB(含50g/mL氨苄青霉素),用
记号笔写好编号。
(2)在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过,镊取一支无菌牙签。用牙
签的尖部接触转化的平板培养基 上的一个白色菌落,然后将牙签放入盛有3mL LB(含50g/mL氨苄青霉素)的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落,分别装入3个摇菌管中。
(3)37℃摇菌过夜后,用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。
(4)提取到的3管质粒样品可用PCR法扩增,或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源
插入片断(方法见有关实验)。
(5)将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大
培养提取其质粒或进行诱导表达,或取500L菌液与500L 65%甘油混合后-80℃保存。
(6)在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面
附:目的基因PCR(选做)
在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。(以下加样量供参考,括号内是最终需要量,实验时需参
照Taq酶说明书计算)
dd water 32μl
10×PCR buffer(不含MgCl2) 5μl
25mM MgCl2 3μl
2.5mmol/L dNTP 4μl(每种dNTP终浓度0.2mM)
10μmol/L Primer1 2μl(12.5—25pmoles)
10μmol/L primer2 2μl(12.5—25pmoles)
模板质粒 1μl(1×10-3pmoles)
3U/μl Taq酶 1μl(3u)
总体积 50μl
根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序:
① 94℃ 5min
② 94℃ 1min
③ 60℃ 1min
④ 72℃ 1min50s
⑤ goto② 29 times
⑥ 72℃ 10min
PCR结束后,取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。
实验安排:
第一天:14:00 配液,灭菌(2h) 16:30 接种大肠杆菌菌
种,摇菌
21:30 做PCR产物与T载体直接连接
第二天:9:00 再接种,再摇菌,OD合适后,做感受态细
胞(大约6h)
13:00拿出转化体系,冰存
15:00 做转化,涂布(大约2h)
第三天 观察,记录,拍照