谷氨酸发酵工艺研究
山东大学
硕士学位论文
谷氨酸发酵工艺研究
姓名:王勇
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:王玉萍
2002.5.8
山东大学硕士学位论文
摘要
L.谷氨酸又叫麸酸,化学名称为L-ct.氨基戊二酸,是制造味精的前体物质。谷氨酸有着广泛的用途,最主要的就是用来制造作为食品风味增强剂的一水谷氨酸一钠。
/谷氨酸的生产方法主要有三种:一是水解提取法:二是化学合成法;三是微生物发酵法。目前,世界上谷氨酸生产厂商主要采用微生物发酵法来生产谷氨酸。微生物发酵法比其它两种方法更具优点。
当前,国内的谷氨酸发酵与国际水平相比还有一定差距,主要表现为菌种培养、发酵产酸率、糖酸转化率等方面,其实质是谷氨酸发酵工艺水平的落后。卟
本论文实验主要对一级种子的培养和发酵条件及其控制进行了优化。力图通过这些实验,找出更适合谷氨酸生产菌S9114的菌种培养条件和发酵环境,来提高发酵过程中的产酸率和糖酸转化率,以达到提高经济效益的目的。
(种子培养的质量好坏是谷氨酸发酵的重要因素。谷氨酸发酵一级种子的培养过程是:分纯后的谷氨酸生产菌划斜面一传二代斜面一传三代即用有糖斜面对谷氨酸生产菌进行活化一接入摇瓶培养获得生产用一级种子。笔者对菌种活化进行了大胆改进,用肉汤培养基替代有糖斜面。从而使菌种活化缩短了时间,减少了工作量。又对一级种子的培养基进行了优化,调整了葡萄糖和尿素的用量,增加了酵母粉、蛋白胨等成分,得到的一级种子形态均匀、活力旺盛。杖
谷氨酸发酵是一个复杂的生化过程,发酵法生产谷氨酸的基本要素之一就是选择适宜的发酵工艺,控制最佳的工艺条件。培养基是提供谷氨酸生产菌生长繁殖及其代谢生产谷氨酸的营养物质,培养基的各组分对产酸影响很大。通过多次实验,确定了双
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酶水解糖、尿素、混合生物索、无机盐、金属离子对发酵过程中菌体增殖和产酸的影响情况。还对种龄、种量等影响谷氨酸发酵的因素进行了研究,确立了大种量有利于缩短发酵时间,提高设备利用系数。
(本实验论文结合生产实际,深入工厂车间,对谷氨酸发酵过程中酌一些实际问题进行了仔细研究,得出了一些结论性的东西,对发酵生产有现实指导意义。+、关键词:谷氨酸;一级种子;培养基;发酵工艺
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ABSTRACT
L-glutamate,chemicallycalledLxt—aminoglutaricacid,istheprecursorofgourmetpowder.L-glutamateiswidelyusedinourlife,andismainlyusedtoproducemonosodiumglutamate(MSG).
TherefifethreewaystoproduceL—glutanate:1.hydrolysisandextract;2.chemistry.syntheticreaction;3.Microbiologyfermentation.Microbiologyfermentationhasadvantagesovertheothertwomethods.SoitisadoptedbythegreaterpartofMSGproducersintheworld.
Comparedwiththeworld’sadvancedlevel,glutamatefermentationindustryinourcountrystillhasalongwaytogoatpresent,eitherintheaspectofstraincultivationoraceticyieldrateandglucosetransformationrate.Infact.theglutamatefermentationtechnologicallevelinourcountryissomehowbehindthetimes.
Thispapermainlyreportstheworkofoptimizing1“一scalestraincultivatingmediumandfermentationcontrolconditions.Throughtheexperiment,wearelookingforthebeststraincultivatingconditionandfermentationenvironmentforLglutamateproducingstain¥9114soastopromoteaceticyieldrateandglucosetransformationrateandarriveattheaimofincreaseeconomicreturns.
Thequalityofstraincultivationplayanimportantrolein
fermentation.Theprocessof15‘scalestraincultivationis:
tubestrain——◆2删scaletubestrain——+3rdscalestrain,toactivateglutamateproducingbactefiathenaddintowhichcontainliquidmedium,aftercultivationwegot15‘scalecultivationforindustry.Ihavemadeadvancedimprovementof
tubestrainwithliquidmedium,sothatthetimeofstrmn5glutamatepurifiedtubeflasksstrainreplacing
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activatingandworkloadarebothreduced.AndIhaveoptimized15‘scalestrainmedium,revisedtheamountofglucoseandureaandaddedyeastpowerandpeptone,SOwegotevenshapedandactive1“scalestraincultivation.
Glutamatefermentationisacomplicatedbiochemicalprocess,oneoftheessentialsoffermentationmethodiStochooseawell.suitfermentationtechnologytogetthebestcontr01.Mediumprovideglutamateproducingbacteriawithallthenutritionnecessaryforgrowthandtheyieldofglutamate.nlecontentsofmediumhavegreatinfluenceontheyieldofglutamate.Throughmanytimesofexperiment,Ihavestudiedtheinfluenceofcornsugar,urea,compoundbiotin,inorganicsalt,metalliciononbacterialgrowthandyieldofglutamate.AlsoIhaveresearchedonfactorssuchasseed・ageandseedquantitythathaveeffectsonglutamatefermentation.AndIarrivedattheconclusionthatincreasingtheamountofinoculationwillshortenfermentationtimelengthandpromoteequipmentusagerate.
Tllisresearchisbasedonpractice.andhasgaveintensivestudiesonglutamatefermentationprocess,alsoarrivedatsomeconclusiveresultswhichisdirectiveforglutamatefermentation.
Keywords:L-glutamate;1缸-scalestrain;Medium;fermentationtechnology6
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符号说明
GA谷氨酸
Rg残糖
MSG味精
P——Glu焦谷氨酸
PLG聚谷氨酸
PGA—Na焦谷氨酸钠
ADI每日容许摄入量
AGSN一月桂酰基谷氨酸钠GDH谷氨酸脱氢酶
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前言
~、谷氨酸的结构及其理化性质
谷氨酸(Glutamicacid)又叫麸酸,是制造味精的前体物质。谷氨酸有L.型和D.型之分,只有L.型谷氨酸具有生理活性。L.谷氨酸的化学名称为L.a一氨基戊二酸。其化学结构式为:
NH2
H00C—CH2一CH2一CH—C00H
谷氨酸的分子式为c5H904N,分子量为147.13,含氮9.52%,为无色斜方晶系,密度为1.5389/ml。谷氨酸与其它氨基酸一样,熔点很高,超过2000C,并且在接近熔点温度时开始熔化并立即分解。因此,要想准确测得其熔点是很困难的。有人认为,谷氨酸的熔点应在2080C左右。
谷氨酸在水中的溶解度很低,但谷氨酸钠在水中的溶解度却很高,谷氨酸在酒精中的溶解度比在水中的还要低,谷氨酸不溶于乙醚。谷氨酸晶体或在水中主要以兼性离子亦即偶极离子的形式存在。
谷氨酸。位碳原子具有手性,能够将偏振光的偏振面旋转一定角度。L.谷氨酸在水溶液的比旋光度为【a】”D=+12.0,在
HCI中的比旋光度为[n】”D=+31.8…。
L.谷氨酸有酸味12],其阈值为5rag/100ml,D一型谷氨酸无味。L.谷氨酸的一钠盐即味精(MSG)有强烈的肉鲜味,常用作烹调和食品鲜昧剂。谷氨酸一钠为带一分子结晶水的无色具有光泽的
J。
谷氨酸含有一个碱性基团氨基和两个酸性基团羧基,它可以5mol/L针状结晶,属斜方晶系,是八面柱状体,有U、B两种晶形p和酸生成盐也可以和碱生成盐,是一个两性物质。在碱性溶液中,氨基被抑制,谷氨酸的酸性基团便与碱结合成盐并成负离子解离
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出来。在强碱性溶液中,还会生成谷氨酸的二钠盐【4J,但用酸中和会立即生成谷氨酸一钠或谷氨酸。若在酸性溶液中,羧基解离被抑制,氨基与酸基结合成盐,并成正离子解离出来。据测定谷氨酸的等电点为pI=3.22【5】。谷氨酸能使水的介电常数增高,而一般的有机化合物如乙醇、丙酮却使水的介电常数降低。
。一氨基酸的水溶液遇水合茚三酮生成紫蓝色产物。这种颜色反应常被用于a一氨基酸的比色测定和色层分析的显色。
谷氨酸与金属盐在一定pH下反应生成难溶于水的复盐,这种性质在一段时间内被用于提取发酵液中的谷氨酸。
谷氨酸或谷氨酸钠在水溶液中长时间加热(1200C,3小时)会引起完全失水生成焦谷氨酸【6】或焦谷氨酸钠17-9]。
二、谷氨酸的制造方法
谷氨酸的制造方法分为水解提取法、合成法和发酵法三大类。现在水解提取法(蛋白质水解法和从甜菜糖蜜中提取法)与合成法已经停用。目前,世界上味精生产厂商主要采用发酵法生产味精。
1.水解提取法:水解法有植物蛋白质水解法和从甜菜糖蜜提取法。
蛋白质由许多a.氨基酸的分子缩合而成,将蛋白质水解可得到相应的氨基酸。植物蛋白质水解法就是以面筋或豆粕等植物蛋白为原料,加酸水解(也可用碱或蛋白酶,但碱水解得到DL.氨基酸),使蛋白质水解成多种氨基酸,用盐酸法或中和法分离出谷氨酸,再制成味精。此种方法是生产味精的传统工艺。其优点是操作易于掌握,但原料来源少,价格高,得率低,对设备腐蚀大,劳动繁重,故此法已停止使用。
从甜菜糖蜜提取法:甜菜中的谷氨酸一般以谷氨酰胺的形式存在,在制糖过程中,用石灰处理时转化为焦谷氨酸(P—Glu)。因此,存在于糖蜜中的焦谷氨酸被碱水解后可转化为谷氨酸。此
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法历史上是从糖蜜回收蔗糖后的废蜜中提取,由于从甜菜糖蜜回收不经济而停用此法。此法收率低,味精得率仅为糖蜜的2~3%。
2.化学合成法:
化学合成法的生产原料为石油化学品,虽然对设备的腐蚀性不大,但反应阶段多,设备周转困难。合成法生产制造的谷氨酸为消旋谷氨酸,需要进行化学拆分。1963年在日本化学合成谷氨酸投产。我国在六七十年代也进行过合成法的中小型试验,但未工业化。化学合成法制造谷氨酸的方法有十多种,主要的有以下几种:以丙稀腈为原料的合成方法;以糠醛为原料的合成方法;以环戊二烯为原料的合成方法;含同位素标记得15N.DL.谷氨酸合成法。合成法的优点是不用粮食原料,但需要高温高压,设备要求高、严密性好,不适于一般工厂生产。另外,由于公众对此种方法生产制造的味精普遍持
怀疑态度,化学合成谷氨酸1973淀粉生物素其它成分年停产。泰舢f/菌种
3.发酵法:液氨袅磊酶等空气
发酵法生产谷氨酸的原料为
含糖的碳水化合物。在我国,味。\、菇嘎
精生产的主要原料为大米或玉米
淀粉水解糖,东北西北少数厂家发酵液
采用甜菜糖蜜,南方有用甘蔗糖等电育晶
蜜为原料。发酵法生产谷氨酸原
料来源丰富,得率高,成本低,分离
有利于机械化自动化生产,劳动L谷氨酸
强度低,生产率较高,技术改进
的可能性大。对各种味精的制造图1发酵法流程
流程加以比较,可以明显看出,以发酵法最为优越。所以此法为当今世界各味精厂商所普遍采用。但发酵法需要严密的生产管理
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和严格的生化操作,否则会由于微生物感染而造成很大的损失。此外,还需要理想的生产菌种。发酵法的流程见上页图1。
三、谷氨酸的生物合成
由葡萄糖生物合
成谷氨酸的代谢途径
如图2所示:瞪n溉,
葡萄糖由糖酵解
途径(EMP)和磷酸乳酸一1酮§吗
己糖支路(HMP)[10-11]
生成丙酮酸,丙酮酸
脱羧生成乙酰辅酶/赣硼、
A;然后在醛缩酶的
催化下,草酰乙酸和
乙酰辅酶A合成柠檬
酸,进一步生成异柠
檬酸和Q.酮戊二酸,
Q.酮戊二酸有还原隧\
氨基化作用生成谷氨瓣\奠刀兮\檬.氐
酸,菌体内合成的谷
氨酸透过细胞膜,便眵能在发酵液中积累大谷氨酸冀望塑堕堕裁酸2JI]NH3量的谷氨酸。
谷氨酸在菌体内
的生物合成主要靠下
述的两个作用:一是还原氨基化作用,另一是转氨作用。此外,还存在谷氨酸合成酶的作用。
1.还原氨基化作用:还原氨基化作用是在糖代谢生成的a一
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酮戊二酸存在下,在谷氨酸脱氢酶和足够氨的参与下,将酮基还原氨基化。谷氨酸脱氢酶的还原氨基化作用在供氧发酵的条件下需要有以NADP为辅酶的异柠檬酸脱氢酶的共轭作用下才能顺利完成。
2.转氨基作用:转氨基作用是利用已存在的其它氨基酸,经过转氨酶的作用将其它氨基酸与a.酮戊二酸生成L.谷氨酸。
3.谷氨酸合成酶的作用:谷氨酸合成酶的作用是使a.酮戊二酸和谷氨酰胺生成两分子的谷氨酸。有这种作用但不强。
在上述几种作用中,谷氨酸脱氢酶的作用特别强,还原氨基化作用处于主导地位,是主要的作用。
谷氨酸发酵是菌体异常代谢的产物,菌体正常代谢失调时,才能积累谷氨酸。在正常的代谢途径上,柠檬酸由三羧酸循环逐次氧化脱羧生成异柠檬酸、d.酮戊二酸、琥珀酸……可是谷氨酸生产菌,由于n.酮戊二酸脱氢酶相当缺乏,使Q.酮戊二酸不再往下继续氧化生成琥珀酸;同时又由于谷氨酸生产菌具有特别强的谷氨酸脱氢酶,在足量的氨存在时,使a-酮戊二酸转化为谷氨酸。为了获得能量和产生菌体蛋白质合成所需的中间产物,在谷氨酸发酵的菌体生长期,需要异柠檬酸裂解酶反应,走乙醛酸循环途径;但是在谷氨酸发酵的谷氨酸生成期,为了大量积累谷氨酸,最好没有异柠檬酸裂解酶反应,封闭乙醛酸循环,这就需要在长菌期和产酸期控制不同的条件。在理想情况下,谷氨酸发酵可按如下反应进行:
2C6H1206+2NH3+302_2CsH904N+2C02+6H20
Itool葡萄糖生成Itool谷氨酸最高理论收率为81.7%。
四、谷氨酸的应用
谷氨酸的应用主要有以下几个方面:
1.在食品方面的应用
由于L-谷氨酸一钠具有强烈的肉类鲜味,而且是人类所需的12
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重要营养品之一,因而广泛的用于食品加工烹饪调味【l”。它用水稀释3000倍仍有鲜味的感觉[z344】。味精作为食品风味增强剂㈣,是食品的一种基础调味成分。人体摄入味精可以完全消化吸收并进行正常的生理新陈代谢【16】。早在70年代国际上对味精的安全性经过对大小白鼠急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性、致畸性、突然变异性各种毒性试验表明,食用味精是安全的。1987年2月16日至25日在荷兰海牙召开的联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂专家联合委员会第19次会议上,对味精各种毒理性实验的综合评价结果得出了结论,即味精作为风味增强剂,食用是安全的,宣布取消对味精的食用限量,再次确认味精是一种安全可靠的食品添加剂。成人对味精的每日容许摄入量(ADI)没有上限。
2.在医药方面的应用
谷氨酸是构成蛋白质的的氨基酸之一,它可以作为碳氮营养参与机体代谢,谷氨酸被人体吸收后,易与血氨形成谷氨酰胺,能解除代谢过程中氨的毒害作用,因而能够预防和治疗肝昏迷,保护肝脏,是肝脏疾患的辅助治疗药物。
脑组织只能氧化谷氨酸,而不能氧化其它氨基酸,故谷氨酸可以作为脑组织的能量物质,改进和维持大脑的机能。谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂,对于治疗脑震荡或神经损伤,癫痫【17】,以及对弱智儿童均有一定疗效。
谷氨酸盐酸盐(GluHCl)可以用于治疗胃酸不足。谷彝酰胺可治疗综合性胃溃疡、十二指肠溃疡118】、神经衰弱等。通常还将谷氨酸钠、维生素Bl、B6与葡萄糖混合静脉点滴注入。谷氨酸钙可与维生素D合用,以增强吸收。
谷氨酸被小肠吸收后,会产生抗衰老物质谷胱甘肽,参与人体中氧化还原反应,相当于抗衰老剂的作用。谷氨酸对心肌能量代谢和心肌保护起着重要作用【l州。俄罗斯医学营养研究所研究发现,味精能改善胃分泌功能,
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增加胃液数量,提高胃液质量.可治疗胃液酸度过低及慢性萎缩性胃炎。澳大利亚皇家医院研究发现,味精可减轻癌症病人接受化疗过程中产生的副作用,如化学药物对神经系统破坏等。3.在工业方面的应用
用D.谷氨酸合成的聚谷氨酸(PLG)其性质接近天然皮革,具有良好的透气性、较强的抗水性和耐老化性。Y.聚谷氨酸是一种出色的绿色塑料,可广泛用于从食品包装到一次性餐具及其它各种工业用途中。它在自然界可迅速降解,不会造成环境污染。
焦谷氨酸钠(PGA.Na)具有极强的吸湿性【2州,能保持皮肤润泽,防止干裂,并增强皮肤和毛发的柔软和弹性,常被用来制作有保湿功能的化妆品。日本已开发了可用于化妆品中的谷氨酸碱盐。它对皮肤无刺激性,可取代化妆品中的化学基质,市场前景令人乐观。
用月桂酰氯与谷氨酸可以制成N.月桂酰基谷氨酸钠(AGS)肥皂。其洗净、起泡、乳化、分散性能皆较好【2”,对皮肤及粘膜无刺激,可用于洗涤剂及化妆品12“。
4.在农业方面的应用
谷氨酸可与其它金属离子反应用于制造农药。氨基酸铜是良好的杀菌剂,谷氨酸铜既是西红柿保护性杀菌剂,又是防治果树腐烂病的特效杀菌剂。
谷氨酸可与激素配合用作植物生长调节剂。谷氨酸与有的激素配合可以制成柑桔增甜剂,增加柑桔果实的含糖量,降低酸度。谷氨酰胺在植物代谢中也起着重要作用。
‘谷氨酸可以用作微肥载体。在N.P.K.基本满足的条件下,作为叶面喷洒的微肥具有投入少,效益高的特点。近年来国外报道用谷氨酸及其它氨基酸作为微肥载体能更好地发挥微量元素的效果。4
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五、谷氨酸在体内的代谢
成蛋白质,并参与体内其它代谢过程…z、…,‘.f断I]-力物的重味精被食用后,经胃酸作用转化为谷氨酸,被消化吸收后合要营养物质,并具有特殊的生理作用。它虽是一种非必须的氨基酸,但在脱氨基、转氨基、脱羧基、解氨等反映中起着重要作用。谷氨酸在人体各部分组织器官中广泛存在,所占比例十分令人瞩目。例如,血液中的谷氨酸占游离氨基酸的33%,肝脏中占14%,在大脑神经系统的灰质蛋白质和白质蛋白质中分别占24.9%和26.8%。谷氨酸在生物体内的代谢见图3:
图3谷氨酸在体内的代谢
六、谷氨酸生产的历史及前景
1.谷氨酸生产的历史
谷氨酸广泛存在于蛋白质,最早的谷氨酸生产就是从小麦面筋中提取得到。谷氨酸的生产已有百多年的历史。谷氨酸生产发展见表l:
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年代发明人方法
1866德Ritthauson用硫酸水解小麦面筋,提取1908日池田菊苗、铃木从海带汁液中提取‘22】1910日本味之素公司水解法生产
1936美国人从甜菜废液中提取
发酵法生产a一酮戊二酸,用
1946美国人酶法或化学法将此酮酸转换
为L.谷氨酸
1956曰本协和公司以糖质为原料,采用发酵法1962日本味之素以丙稀腈为原料,化学合成
DL一谷氨酸,再拆分
1966日本协和公司采用石油工业副产品醋酸发
酵生产谷氨酸
1977日本协和公司采用糖蜜为原料发酵法生产
谷氨酸
表1谷氨酸生产发展史
2.我国谷氨酸生产的发展情况
我国味精生产始于1923年,在上海天厨味精厂首先采用盐酸水解面筋生产味精。1932年,沈阳味精厂开始用豆粕水解法生产味精。1958年,我国开始筛选用于发酵法生产谷氨酸的菌种并进行了发酵工艺研究。1964年上海天厨味精厂首先采用黄色短杆菌617为生产菌株,发酵生产谷氨酸试验成功。六十年代中后期投产的发酵工艺,进行一次投糖发酵产酸4.5%--6%。到了七八十年代,甜菜糖蜜(加抑制剂法)发酵生产谷氨酸投产,产酸率6~8%,转化率50%左右,连续低糖流加发酵工艺中试成功。经过
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近三十年的努力,通过改革工艺和引进技术消化吸收,各项技术指标提高得很快[23-29】。据行业统计,2001年度全国味精企业产酸最高达到达到12.25%;发酵转化水平最高达到62.60%;发酵提取水平最高达到了99.98%川。
3.前景展望
味精作为调味品,越来越受到人们的欢迎。我国是世界上人口最多的国家,是世界上最大的味精消费市场之一。有关资料显示,目前我国人均味精消费水平还很低,每人每年仅20克。随着物质生活水平的不段提高,人们对味精的需求量将会越来越大。我国生产的味精其晶形、透光、白度、含量、鲜味程度等质量指标远远超过世界其它地区以糖蜜为原料制作的味精,我国味精在国际市场上有很强的竞争力。目前国际市场上对味精的使用己不仅仅局限于调味上,而是更广泛的作为一种原材料或香料表面滑性剂应用于食品工业、医药和化妆品生产行业。近年来亚洲食品工业对味精的需求增长率高达5~6%;据国外食品专家估计,到2004年,全球味精需求年增长率平均可达4.1%。当然,随着我国加入WTO,国际市场味精势必会大量涌入中国,市场竞争会更加激烈,给国内企业带来巨大压力。由此可见,在将来一段时间内,国内味精生产厂商将面临机遇与挑战。
截至到1999年底,我国味精产量已达65万吨13”,成为世界上的第一大味精生产国。但是,我们的味精生产工艺水平与世界先进水平相比还有差距。主要表现为:发酵产酸率、糖酸转化率、菌种培养、开发新菌种等方面与国外先进水平有很大差距,尤其是生产自动化水平差距更大。因而,我们有必要花大力气研究谷氨酸发酵工艺,这种研究不因谷氨酸早已大规模生产而停止。
目前,谷氨酸发酵研究的课题主要有:(1)寻找开发新菌种,提高糖类发酵的产酸率。国外(主要是日本)已将研究重点转向利用基因工程技术改良菌种。”“。(2)开发新资源,寻找开发廉价原料发酵生产谷氨酸。(3)开发新工艺。(4)优化操作控制,包括生
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产工艺参数控制及细胞内代谢调控。(5)有关从发酵液中分离提取谷氨酸新技术的研究。
本论文实验对一级种子的培养和发酵条件及其控制进行了优化,对谷氨酸发酵过程中的一些实际问题进行了仔细研究。
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第一部分分析测定方法
实验中涉及到的分析测定方法主要有谷氨酸的测定、葡萄糖的测定以及谷氨酸脱氢酶的测定。
一、谷氨酸的测定
(一)用SBA-40C型生物传感分析仪测定:
1.原理:
SBA--40C型系列生物传感分析仪利用酶促反应来定量,样品分析工作原理如下:
固定化酶
底物+02+1-120——————◆产物+H202
在谷氨酸测定中底物为谷氨酸,固定化酶为谷氨酸氧化酶,产物为Ⅱ.酮戊二酸与NH4‘。
样品经稀释后(要求pH在6~8左右),由定量进样针吸取比例混合均匀,底物透过酶膜圈的外层与固定化酶层接触并反应,反应放出的H202再透过酶膜圈的内层与白金一银电极接触,并产生电流信号,该电流信号与底物的浓度成线性比例关系,经微2.样品稀释:
取lml发酵液稀释100倍,待测。
(1)开机,自动清洗反应池一次。(2)进样灯(绿灯)亮并闪动,且当屏幕处于自动零状态的O25ul,并注入反应池,含有样品的底物在样品室内迅速按照一定机控制的信号,可直接显示并打印结果。3.测定方法:SBA--40C型分析仪测定操作步骤为:
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值时,把吸取好的25ul标准样品注入进样口。
(3J20秒反应结束后,仪器自动开始定标,屏幕显示设定的标
值,并自动清洗反应池。
(4)反复按2—3的要求测定标准样品,当仪器稳定后,即前后
两针的结果相对误差小于1%时,仪器便自动定好标,标值是进样灯(绿灯)一直亮但不闪动。’
(5)将预先稀释好的样品用与标准样品相同的方式进行测定。
屏幕直接显示的数值是最后的测定结果。
(6)同一样品测定三针或三针以上,再进行统计,可以得到更
准确的统计值。
4.计算:
GA%=读数X稀释倍数/100
(二)华勃氏减压法测定谷氨酸的含量防36】:
1.原理:
利用专一性强的大肠杆菌脱羧酶(又名L.谷氨酸脱羧酶),在定温和定体积下,与L一谷氨酸起作用,放出二氧化碳气体,气体量的改变可由其压力的改变而测定,因此以二氧化碳的量推算出谷氨酸的含量。
L.谷氨酸脱羧酶,370C,pH5,0
COOH(CH2)2CHNH2COOH—————————‘——————‘——————————————————◆COOH(CH2)2CH2NH2+C02T
由此可见,二氧化碳:L.谷氨酸=1:1
2.试剂配制:
减压液(Brodie):称取10克吐温20或5克牛胆酸钠,25克氧化钠,少量伊文氏蓝,定容500ml,用氧化钠和蒸馏水调密度至1.0339Ccm3。此液装于减压仪上约一个月更换一次。PH值5醋酸一醋酸钠缓冲液:准确称取三水醋酸钠27,00克
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或无水醋酸钠6.4克,加6N的醋酸10毫升,用蒸馏水定容至1000毫升,即为pH5.0缓冲液。
2%大肠杆菌酶液:称取大肠杆菌酶制剂2克,加pH5.0的上述缓冲液100毫升制成。
2M醋酸一醋酸钠缓冲液:称取272.18克醋酸钠加水溶解,加醋酸调至pH4.8—5,定容至1000毫升。
3.测定方法:
取l毫升样品加蒸馏水稀释至25毫升,摇匀,取稀释液0.5毫升加入反应瓶主室内,再加1.6毫升pH5的醋酸一醋酸钠缓冲液。侧室内加入0.4毫升2%大肠杆菌脱羧酶液。插上侧室瓶塞,将反应瓶与减压管连接,均以无水羊毛脂密封。以小弹簧或橡皮筋固定。将减压管固定在振荡板上,放于37±0.010C的恒温水槽内,打开三通阀与大气相通,将减压液调至250毫米,开启振荡(频率约为100次每分左右),平衡lO分钟后,关闭右管上面的三通阀,调节减压液于150毫米处,振荡5分钟后读数,达到平衡后记下刻度(此为反应前读数)。接着把侧室酶液倒入主室内,稍加摇动后放入水溶液中继续振荡让其反应,10分钟后调节右管减压液于150毫米处,振荡3分钟后开始读数,左管减压液不再上升后,记下刻度(为反应后读数)。打开三通阀,取出减压针,析出反应瓶清洗烘干备用。
空白校正:反应瓶内以2.5毫升蒸馏水代替,其余操作方法同上。
3.计算:
【(h目一hlit)±h!×K#】X13.
GA%=
V
式中v——样品毫升数
hn——反应前度数(毫米)h。——反应后读数(毫米)
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h±——空白读数(毫米)
K。——测定谷氨酸时的反应瓶常数
n——稀释倍数
测定反应瓶常数K值的方法为反应标定法:取已烘至恒重的标准谷氨酸,称取0.25克用蒸馏水溶解定容至100毫升,此溶液含谷氨酸浓度为O.25%,可按上述华勃氏测定谷氨酸的方法求出K。值,按以下公式计算,即可以求出K*的值。
GA%=(n±n±)×K§
式中GA%——已知数,为O.25%
n±nt——(反应后一反应前的压力差)±空白压力差
二、葡萄糖的测定
用斐林氏法测定葡萄糖‘”1:’
1.原理:
还原糖在碱性溶液中能够将Ag+,Hg+,cu”,Fe(CN)63一等金属离子还原,而糖本身则氧化成各种羟酸,利用这一特性可以对还原糖进行测定。
测定中的氧化剂为斐林试剂,它由甲乙两种溶液组成,甲液中含有硫酸铜、次甲基蓝;乙液中含有氢氧化钠、酒石酸钾钠和亚铁氰化钾(黄血盐)。
当甲乙两液混合时,硫酸铜和氢氧化钠作用形成氢氧化铜沉淀。由于溶液中存在酒石酸钾钠,它和氢氧化铜形成了可溶性的络合物一酒石酸络铜(I-I)钾钠盐。酒石酸络铜(兀)钾钠盐在与还原糖共热时,二价铜离子即被还原成一价的氢氧化亚铜红色沉淀。此氧化亚铜与试剂中亚铁氰化钾反应生成可溶性的亚铁氰酸络铜(I)钾盐。
斐林试剂中二价铜的还原力比次甲基蓝强,因此所滴入的标准葡萄糖溶液首先使二价铜还原,只有当二价铜被还原完毕后,才能使次甲基蓝还原为无色,测定中以此作为终点。
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2.试剂配制:
斐林氏甲液:15克硫酸铜、0.05克次甲基蓝溶于1升蒸馏水中。
斐林氏乙液:50克洒石酸钾钠、54克氢氧化钠、4克铁氰化钾溶于1升蒸馏水中。
O.1%标准葡萄糖溶液:准确称取干燥至恒重的葡萄糖1.00克,加入少量蒸馏水溶解后,再加8ml浓盐酸(防止微生物生长),用蒸馏水定容至1升。
6N盐酸和6N氢氧化钠。
3.测定方法:
在三角瓶中加入斐林试剂甲乙液各5ml和待释样品5ml。将其置于电炉上,保证其处于沸腾状态,快速滴定,直至蓝色消失。4.计算:
在滴定时先做一对照(不加样品),用标准葡萄糖滴定。求知一定体积斐林试剂中二价铜和次甲基蓝的量,即测定对照消耗的标准葡萄糖量(A)。再做样品管,样品中还原糖消耗斐林试剂中一部分二价铜,剩余的量再用标准葡萄糖来滴定,即样品消耗的标准葡萄糖量(B)。
(A—B)X葡萄糖浓度rag/m1×样品稀释倍数
还原糖%=×100
吸取测定毫升数X样品量
三、谷氨酸脱氢酶(GDH)的测定
谷氨酸脱氢酶活性的测定:每只试管中加3ml菌液再加入lml次甲基蓝,迅速摇匀,开始记录时间,直至试管中蓝色消失。从开始记录时间,到蓝色消失为止,用这段时间来表示谷氨酸脱氢酶的活性。时间越短表明活性越高,反之活性低。发酵过程中谷氨酸脱氢酶的活性一般从几十秒到两分钟左右。
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第二部分种子培养条件的优化
谷氨酸发酵同其它发酵一样,在发酵培养基中需要按比例接种一定数量均匀健壮的种子进去,才能使发酵正常进行。因此,在谷氨酸发酵前必须先培养好~定数量、健壮、均匀、活力旺盛的种子,这个工作我们称之为种子培养。种子培养的质量好坏是影响谷氨酸发酵的重要因素。影响种子培养质量的因素是多方面的,除了菌种本身的培养特性和生理特性外,培养基的性质、培养温度、DH值、供氧状况、无菌操作等对种子的质量影响也很大。
国内谷氨酸发酵种子扩大培养普遍采用二级种子扩大培养的流程,即:斜面培养一一级种子培养一二级种子培养一发酵罐。
菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸,并要求斜面在生产中斜面培养菌种活化的流程大体是:分纯后的谷氨酸生产菌划斜面一传二代斜面一传三代即有糖斜面对谷氨酸生产菌
(一)材料和方法:
1.菌种:
谷氨酸生产菌¥9114138I(由菱花集团菌种室提供)
2.培养基:
有糖斜面培养基(g/L):葡萄糖1.蛋白胨10,牛肉膏10,氯化钠5,琼脂粉20,pH7.0,分装,121oC灭菌15rain一、谷氨酸生产菌活化菌种绝对纯,不得混有任何杂菌和噬菌体,培养条件应有利于菌种的繁殖,培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。菌种的移接,一般只传代三次,以免菌种自然变异引起菌种退化。进行活化一接入摇瓶培养获得生产用一级种子。我们首先对有糖斜面活化谷氨酸生产菌这一中间环节进行了改进和优化。
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肉汤培养基(g几):葡萄糖l,蛋白胨10,牛肉膏lO,氯化钠5,pi47.0,分装200ml/1000ml三角瓶,1210C灭菌15min
3.培养条件:
谷氨酸生产菌用有糖斜面活化的培养条件是,用接种环刮取菌种到斜面涂布均匀,320C培养18~24h。培养完成后,仔细观察菌苔的颜色和边缘等特征是否正常,有无感染杂菌和噬菌体的征兆。然后,置于40C冰箱中保藏待用。
谷氨酸生产菌用肉汤培养基活化的培养条件是,用接种环刮取满满一环菌种到肉汤培养基中,然后将其置于频率为100次/min,冲程为80mm的摇床上,320C培养。
(二)实验结果:
1.生长曲线:
用肉汤培养基按上述培养条件培养24小时,得到¥9114在肉汤培养基中的生长曲线为:
图2.1生长曲线
O
一一0.5
三一1
c一1.5
—2
—2.5
根据此生长曲线我们确定肉汤培养基活化谷氨酸生产菌¥9114应在生长6~8小时后下摇床。
2.pH值曲线
肉汤培养基l(g/L):葡萄糖0,蛋白胨10,牛肉膏10,氯化钠5,pH7.0,分装200mFlOOOml三角瓶,1210C灭菌15rain
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肉汤培养基2(g/L):葡萄糖1,蛋白胨10,牛肉膏10,氯化钠5,pH7.0,分装200ml/1000ml三角瓶,1210C灭菌15min
肉汤培养基3(g/L):葡萄糖2,蛋白胨10,牛肉膏10,氯化钠5,pH7.0,分装200m1/lOOOml三角瓶,12loC灭菌15min
用肉汤培养基按上述培养条件培养9小时,得到¥9114在肉汤培养基中生长时的pH值曲线:
图2.2pH值曲线
7.4
7.2士Q7
6.8一系列l+系yt]2
6.6+系y,J3
6.4
pH值曲线表明,菌种生长过程中培养基中的pH值先是下降,然后逐渐升高。这是因为在菌体消耗葡萄糖繁殖的过程中菌体代谢产生了有机酸使pH值不断降低;其后,随着葡萄糖的耗尽菌体对蛋白胨、牛肉膏进一步利用产生了比原来多的碱性物质使的pH值逐步升高。
肉汤培养基中葡萄糖的含量对pH值曲线有很大影响。葡萄糖含量越高,曲线上pH值就越低。虽然葡萄糖含量高,会得到较大的AOD值,但是实验及生产实际都表明过低的pH值容易使菌种老化【39l。葡萄糖的含量越低,曲线上pH值就越高,过高的pH会值抑制菌体增殖【39J。因而,我们选用了葡萄糖含量为0.1%的肉汤培养基。根据生长曲线、口H值曲线以及实际应用的情况,我们选取
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了生长时间分别为6.5h、7h、7.5h的菌种置于冰箱中40C冷藏至24h,测定其pH值分别为:6.91、702、7.10。我们认为,用肉汤培养基活化¥9114的最佳生长时间为7h。
我们对用肉汤培养基活化的¥9114和用有糖斜面活化的¥9114进行了菌体形态的比较:显微镜下二者均生长均匀、健壮、。排列整齐。2001年6月在菱花集团四车间进行了18批次大罐对比实验表明:¥9114用肉汤培养基活化产酸能力虽没有显著提高,但也不会降低。
用肉汤培养基活化谷氨酸生产菌主要有以下优点:首先,我们可以控制接种到摇瓶中种量保持一致,这样就使我们得到到的一级种子质量均匀平稳:其次,改用肉汤培养基接种,操作迅速,在一定程度上减少了染菌的几率:再者,使工作量大大降低。过去为了满足生产需要,每天都要做大量斜面菌种。改用肉汤培养基后,每天只需要制作两三角瓶菌种足以。这样就大大降低了劳动强度,节约人力资源。
二、一级种子培养优化
种子培养是让菌体细胞在充分的营养条件和适宜的培养条件下繁殖,不需要产酸,因此种子培养必须有适于菌体细胞繁殖的营养成分。一般种子培养基必须具有适当的碳源、充足的氮源及其它必要的生长因素等。培养基中所含固形物不宜太高,这样有利于细胞摄取营养,使细胞迅速地进行繁殖。
种子培养基所用的碳源一般是利用淀粉水解糖,或者商品葡萄糖,培养基中水解糖的浓度不宜过高,如糖分过高会引起产酸菌种老化。所用的氮源有玉米浆和尿素,玉米浆营养丰富含有大量生物素和多种维生素。
(一)材料和方法:
1.菌种:谷氨酸生产菌¥9114(由菱花集团菌种室提供)
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2.培养基:
原有一级种子培养基配方:葡萄糖2.5%,尿素O.59%,玉米浆3%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁O.04%,牛肉膏O.4%,NaOH调pH7.0,1210C灭菌15rain
3.培养条件:
将10ml肉汤培养基接入1200mF5000ml三角瓶,然后将其置于频率为85次/min,冲程为80mm的摇床上,320C培养。
(二)实验结果:
1.葡萄糖浓度对一级种子pH值的影响:
实验表明一级种子pH值变化的基本规律是:一级种子培养基(有糖)在种子培养过程中pH值先是下降,再升高,最后再次下降。
我们在固定其它成分含量不变的情况下,以葡萄糖含量为变量得到了一组数据见表2.1:
表2—1葡萄糖浓度对最低pH值的影响
葡萄糖量01%2%3%
pH最低值+7.016.606.265.98*pH最低值指pH曲线上pH值首次下降所达到的最低值
这表明在~定程度上葡萄糖含量越高pH值就会越低,
这对菌体生长不利。因此,我们在保证OD值净增足够的情况下,少用葡萄糖。
2.尿素浓度对一级种子pH值的影响:
我们在固定其它成分含量不变的情况下,以尿素含量为变量得到了一组数据见表2.2:
表2.2尿素浓度对最高pH值的影响
尿素含量0.4%0.5%0.6%
PH值最高值6.917.207.60这表明在一定程度上尿素含量越高pH值就会越高,高的pH
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值对菌体生长不利。同时,大量实验表明培养基中的C、N比要符合一定的比例。
3.一级种子培养基比较:
原有的一级种子培养基为:葡萄糖2.5%,尿素0.59%,玉米浆3%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.04%,牛肉膏0.4%,NaOH调pH7.0
我们经过多次正交实验、均匀设计实验【40珈】,最终确定了一级种子培养基配方为:葡萄糖1.2%,尿素0.5%,玉米浆1%,磷酸氢二钾0.12%,硫酸镁O.04%,牛肉膏O.5%,蛋自胨0.5%,酵母粉0.5%,NaOH调pH7.0
新旧培养基比较见表2.3:
表2-3种子质量指标
通过上表不难看出,新培养基比原有培养基培养的的一级种子指标要好。另外,通过三次发酵小试,新培养基培养的一级种子比原培养基培养的~级种子产酸高约数个百分点。目f;{『实验还在进一步进行之中。
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本部分小结:
本部分实验主要研究了谷氨酸生产茵的活化和一级种子的培养。我们用肉汤培养基活化谷氨酸生产菌¥9114在生产上收到了很好的效果。它具有多方面的优点。另外,我们很好的把握了种子培养中的C、N比例,大胆的对一级种子培养基做了较大调整,效果也还不错。30
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第三部分发酵工艺研究
以淀粉水解糖为原料,发酵法生产谷氨酸的基本要素,是采用优良的菌株和控制适合的环境条件Ⅲ4“。谷氨酸生产菌所以能够在体内合成谷氨酸,并排出于体外,关键是菌体的代谢异常化,即长菌型细胞在生物索亚适量条件下,转变成伸长、膨大的产酸型细胞。这种代谢异常化的菌种对环境条件是敏感的。条件控制适当,高产谷氨酸,只有极少量的副产物;否则,条件控制不合适,代谢途径发生变化,少产或几乎不产谷氨酸,代之得到的是大量菌体,或者由谷氨酸发酵转换为积累乳酸、琥珀酸、a一酮戊二酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺等发酵。由此可见,谷氨酸发酵是一个复杂的生化过程。它是建立在容易变动的代谢平衡之上的,经常受到环境条件的影响。菌种的性能越高,使其表达接近它应有的生产潜力所必须的条件就越难满足,对环境条件的波动更为敏感。故要想获得高酸、高转化率、高效益的谷氨酸发酵生产,除了选择优良的谷氨酸生产菌外,还必须按所用菌株的特性,选择适宜的发酵工艺,控制最佳的发酵工艺条件。
培养基是供谷氨酸生产菌生长繁殖及代谢生产谷氨酸的营养物质。它的成分及配比合适与否对菌体正常生长及积累谷氨酸会有很大影响【471,同时也关系到将来产品的提取㈨及精制质量。从发酵工程的角度来说,纵然有优良的菌种,但是没有合适的培养基,谷氨酸发酵还是不会取得成功的。由于菌种不断更新,或虽同一株菌,经长时间使用后,在性能上也会出现一些差异,以及原料批次的变换等因素,培养基的配比不是一成不变的。实际上,它经常在调整.我们必须把培养基与各种因素有机地联系起来。
要使谷氨酸高产稳产,必须认识与掌握谷氨酸生产菌活动的规律,根据菌种性能和发酵特点,用发酵条件来控制发酵过程中
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各种化学及生物化学反应的方向和速度。谷氨酸发酵过程可分为三个阶段,长菌阶段、长菌型细胞向产酸型细胞的转移阶段与产酸阶段。发酵条件控制一般包括:发酵过程温度的控制、pH值控制、种龄与种量的控制、通风与AOD值控制、以及菌体形态变化与OD的变化等等。
一.碳源
碳源是构成菌体和合成谷氨酸碳架及能量的来源。谷氨酸生产菌是异养微生物,只能从有机化合物中取得碳源营养,并利用分解氧化有机物产生的能量来供给细胞中合成反应所需的能量。现生产上使用的谷氨酸生产菌都不含淀粉酶而不能利用淀粉,只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等,故淀粉需先经糖化制成淀粉水解糖后,才能利用。
培养基中初糖浓度对谷氨酸发酵有很大影响。在一定范围内,谷氨酸产量随糖浓度的增加而增加,但是糖浓度过高,由于渗透压增大,对菌体生长和发酵均不利,当工艺条件配合不当时,发酵中的谷氨酸产率及糖酸转化率极低。淀粉水解糖质量对谷氨酸发酵的影响很大。
(一)初糖浓度对发酵过程中菌体增殖【49】的影响
1.材料和方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌¥9114
(2)培养基:尿素0.4%,磷酸氢二钾O.13%,硫酸镁O.06%,
玉米浆0.8%,Fe2+2ppm,Mn2+2ppm,VBllOOug/L,菌体水解液0.1%,葡萄糖的量分别为:10%,20%,25%,30%,40%,调节pH值7.0,装液量19ml/500ml三角瓶,1210C灭菌8分钟
(3)培养条件:将lml种子液接入发酵培养基中,置其于频率为100次/分钟,冲程为80mm的摇床上,320C培养,
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中间不流加尿素。
2.实验结果:
培养9hr后下摇床用722分光光度计测定OD值(波长620nto稀释20倍),其结果见图3-1:
凸
昌图3-1初糖对菌体增殖的影响
06
04
0.2
0
10152025303540
葡萄糖%
3.结果分析:
实验结果表明在发酵过程中低浓度的葡萄糖有利于谷氨酸生产菌¥9114的菌体生长。随着培养基中葡萄糖浓度的增大,菌体△OD降低。当葡萄糖浓度达到40%时,菌体几乎不生长。这是因为,随着葡萄糖浓度的升高,渗透压增大,不利于菌体的生长。
(二)不同浓度葡萄糖对产酸的影响
1.材料和方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌¥9114
(2)培养基:尿素O.4%,磷酸氢二钾O.13%,硫酸镁O.06%,
玉米浆O.8%,Fe2+2ppm,Mn2+2ppm,VBl100ug/L,菌体水解液0.1%,葡萄糖的量分别为:8%,1l%,14%,17%,20%,调节pH值7.0,装液量19ml/500ml三角瓶,121oC灭菌8分钟
(3)培养条件:将lml种子液接入发酵培养基中,置其于频率为110次/分钟,冲程为80mm的摇床上320C培养;8hr时频
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率提至115次/分钟,提温提至340c培养;12hr时频率提至120次/分钟,提温提至350C培养,18.5hr下摇床。其间各流加40%o尿素lml,总的耗脲量为2.2%。
2.实验结果:
培养结束后取发酵液稀释100倍,用谷氨酸分析仪SBA--40C测定,其结果见图3—2:
图3-2初糖对发酵的影响
66
55
§44^
—3一30
《
(92—2旦
11+Rg—._GA
OO
811141720
初糖浓度(%)
3.结果分析:
实验结果表明随着葡萄糖浓度的升高,产酸先升高后降低。11%葡萄糖组产酸最好,18.5hr达到了5.7%。这说明适宜的初始葡萄糖浓度有利于谷氨酸生产菌更好的发挥自身性能,高产谷氨酸。
二.氦源
氮源是合成谷氨酸生产菌菌体蛋白质、核酸等含氮物质和合成谷氨酸氨基的来源。同时,在发酵过程中一部分氮用于调节pH值,形成谷氨酸铵盐。因此,谷氨酸发酵所需的氮源比一般发酵工业高;一般发酵工业碳氮比为100:0.2~2.0,谷氨酸发酵的碳氮比为100:20~30,当碳氨比在100:11以上时才开始积累谷氨酸。在谷氨酸发酵中,用于合成菌体的氮仅占总耗氮的3~8%,
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而30~80%用于合成谷氨酸。在谷氨酸发酵过程中,需正确控制碳氮比,在发酵的不同阶段,控制不同的碳氮比,以促进菌体以生长为主阶段向以产酸为主阶段转化。在长菌阶段NH4+过量会抑制菌体生长,产酸阶段不足会造成n.酮戊二酸的积累。氮源有无机氮和有机氮,菌体利用有机氮较为迅速。
(一)初始尿素浓度对产酸的影响
1.材料与方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌¥9114
(2)培养基:葡萄糖11%,磷酸氢二钾O.13%,硫酸镁0.06%,
玉米浆O.8%,Fe2+2ppm,Mn2+2ppm,VBll00ug/L,菌体水解液0.1%,尿素的量分别为:0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%,调节pH值7.0,装液量19ml/500ml三角瓶,1210C灭菌8分钟
(3)培养条件:将lml种子液接入发酵培养基中,置其于频率
为110次/分钟,冲程为80ram的摇床上320C培养;8hr时频率提至115次/分钟,提温提至340C培养:12hr时频率提至120次/分钟,提温提至350C培养,15hr下摇床。其间根据口H值的变化流加40%尿素,各组总的耗脲量不尽相同。2.实验结果:
培养结束后取发酵液稀释100倍,用谷氨酸分析仪SBA--40C测定,其结果见图3.3:
j.结果分析:
实验结果表明随着初脲浓度的升高,产酸先升高后降低。0.4%尿素组产酸最好,15hr达到了5.1%。4.5h时取样测其OD值,发现O.4%尿素组OD值最高。这在一定程度上说明菌体生长的好坏、OD值的净增与产酸很有关系。
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图3-3初脲对产酸的影响
6
5
墓:
舌;
0
0.20.40.60.8l12
初脲浓度(%)
(二)流加尿素对发酵的影响
1.材料与方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌¥9114
(2)培养基:葡萄糖21%,尿素O.4%,磷酸氢二钾O.13%,硫
酸镁0.06%,玉米浆0.8%,Fe2+2ppm,Mn2+2ppm,VBll00ug/L,菌体水解液0.1%,调节pH值7.0,装液量19ml/500ml三角瓶,40%尿素,1210C灭菌8分钟
(3)培养条件:将lml种子液接入发酵培养基中,置其于频率
为110次/分钟,冲程为80mm的摇床上320C培养,根据实际情况逐级提温,并提高摇床频率。最后温度提至37~380C,摇床频率为120次/分钟,整个发酵过程用时38.5hr。
2.实验结果:
培养结束后取发酵液稀释100倍,用谷氨酸分析仪SBA--40C测定,其结果见表3.1:表3-1流加尿素对发酵的影响
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3.结果分析:
实验结果表明O.5ml组产酸最高,0.7ml组次之,0.9ml组产酸最低。这是因为一次补加的尿素量越大脲酶【50_511分解尿素后培养基的pH值就越高,过高的pH值抑制了前期菌体的生长,并对菌体的生理性能造成损害。我们采用的流加量为0.5ml/次。我们没有采用更低的流加量这是因为随着流加次数的增多,劳动量会增加,另一重要原因就是流加次数多染菌机会大。
三.生物素[52-53I
生物素属于B族维生素,称为维生素H或辅酶R。生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶已酰辅酶A羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响磷脂的合成。当磷脂的合成减少到正常量的二分之一左右时,导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜,细胞变形,谷氨酸向膜外漏出,积累于发酵液中。为了形成有利于谷氨酸向外渗漏的磷脂合成不足的细胞膜,必须亚适量控制生物素。
(一)玉米浆作为生物素唯一来源
1.材料和方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌S9114
(2)培养基:葡萄糖21%,尿素O.4%,磷酸氢二钾0.13%,硫
酸镁0.06%,Fe2+2ppm,Mn2+2ppm,VBllOOug/L,菌体水解液0.1%,玉米浆0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%,1.4%,1.6%,调节pH值7.0,装液量19rnl/500ml三角瓶,1210C灭菌8分钟
(3)培养条件:将lml种子液接入发酵培养基中,置其于频率
为1lO次,分钟,冲程为80mm的摇床上320c培养,根据实际情况逐级提温,并提高摇床频率。最后温度提至37~380C,摇床频率为120次/分钟,整个发酵过程用时39hr,流加40
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%尿素每次O.5ml。
2.实验结果:
培养结束后取发酵液稀释100倍,用谷氨酸分析仪SBA--40C测定,其结果见图3-4:
图3—4玉米浆含量对产酸的影响
14
12
10
8
6
4
O.4O.81.21.6
玉米浆(%)
3.结果分析:
实验结果表明随着玉米浆浓度的升高,产酸升高,在1.4%时达到产酸最高,随后产酸降低。因而,生产上控制生物素的亚适
(二)混合生物素对产酸的影响
1.材料和方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌¥9114
(2)培养基:葡萄糖21%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.13%,硫
酸镁0.06%,Fe”2ppm,Mn2+2ppm,Vll100ug/L,菌体水解液0.1%,生物素含量:a玉米浆1.4%,b玉米浆O.6%+糖蜜O.2%,c玉米浆0.7%+糖蜜O.25%,调节pH值7.0,装液量19ml/500ml三角瓶,1210C灭菌8分钟(3)培养条件:将Iml种子液接入发酵培养基中,置其于频率量意义重大。实验表明玉米浆浓度越大菌体的OD净增越大。生物素过量就会只长菌不产酸或长菌好产酸低;生物素不足菌体生长不好,表现为长菌慢、耗糖慢、pH值偏高、周期长、产酸低。
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为110次/分钟,冲程为80mm的摇床上320C培养,根据实际情况逐级提温,并提高摇床频率。最后温度提至37~380C,摇床频率为120次/分钟,整个发酵过程用时40hr,流加40%尿素每次O.5ml。
2.实验结果:
培养结束后取发酵液稀释100倍,用谷氨酸分析仪SBA--40C测定,其结果见表3—2:
表3—2复合生物素对产酸的影响
3.结果分析:
实验结果表明采用复合生物素玉米浆加糖蜜的效果要比只用玉米浆的效果要好。糖蜜中含有较高的生物素,但氨基酸等有机氮含量较低。实际生产中为了减少某一种原料变动给生产带来的较大波动,常常采用两者相结合的方法。
四.无机盐
无机盐是谷氨酸生命活动中不可缺少的物质。其主要功能是构成菌体成分;作为酶的组成部分:酶的激活剂或抑制剂;调节培养基的渗透压;调节pH值和氧化还原电位等等。谷氨酸生产菌所需要的无机盐为磷酸盐、硫酸盐、氯化物和含钾、镁的化合物。谷氨酸菌对无机盐的需要量不多,但无机盐的含量对菌体生长与代谢有很大影响。
(一)硫酸镁对发酵产酸的影响镁是组成某些细菌叶绿素的成分,它的离子状态是许多重要
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的酶(如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂,能刺激菌体生长。硫是构成蛋白质和某些酶的活性基。
1.材料和方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌¥9114
(2)培养基:葡萄糖21%,尿素0.4%,玉米浆O.6%,糖蜜O-2
%,磷酸氢二钾0.13%,Fe2+2ppm,Mn2+2ppm,VBl100ug/L,菌体水解液0.1%,硫酸镁的量为0、O.03%、0.06%、0.09%,调节pH值7.0,装液量19ml/500ml三角瓶,1210C灭菌8分钟
(3)培养条件:将lml种子液接入发酵培养基中,置其于频率
为110次/分钟冲程为80mm的摇床上320C培养,根据实际情况逐级提温,并提高摇床频率。最后温度提至37~380C,摇床频率为120次/分钟,整个发酵过程用时38.5hr,流加40%尿素每次O.5ml。
2。实验结果:
培养结束后取发酵液稀释100倍,用谷氨酸分析仪SBA--40C测定,其结果见表3.3:
表3.3硫酸镁对产酸的影响
丝g墨垒f塑!!:鳗!:堕!:Q!残糖(%)0.20.30.10.1产酸(%)12.012.312.312.13.结果分析:
实验结果表明M92+的浓度对产酸没有显著影响。这是因为用来配制培养基的水我们采用的是深井水含有微量Mg外。另外,培养基的其它组分中也含有少量的M92+。
(二)磷酸盐对发酵的影响磷是某些蛋白质和核算的组成部分:腺二磷(ADP)、腺三磷
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(ATP)是重要的能量传递者;参与一系列的代谢反应,如糖代谢中主要步骤之一就是磷酸化作用;磷酸盐在培养基中还有缓冲作用。磷含量高低对谷氨酸发酵影响很大,磷浓度过高时菌体代谢转向缬氨酸;若磷含量过低,菌体生长不好,表现为耗糖慢、残糖高、菌体生长缓慢。工业上常用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等磷酸盐。玉米浆、糖蜜、淀粉水解糖等原料中还有少量的磷。
1.材料和方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌S9114
(2)培养基:葡萄糖21%,尿素0.4%,玉米浆0.6%,糖蜜0.2
%,氯化钾0.13%,Fe”2ppm,Mn”2ppm,VBll00ug/L,菌体水解液0.1%,磷酸氢二钠的量为O.06%、0.09%、0.012%、0.Ol5%,0.18%,0.21%,调节DH值7.0,装液量19ml/500ml三角瓶,1210C灭菌8分钟
(3)培养条件:将lml种子液接入发酵培养基中,置其于频率
为110次/分钟冲程为80mm的摇床上320C培养,根据实际情况逐级提温,并提高摇床频率。最后温度提至37~380C,摇床频率为120次/分钟,整个发酵过程用时39hr,流加40%尿素每次0.5ml。
2.实验结果:
培养结束后取发酵液稀释100倍,用谷氨酸分析仪SBA--40C测定,其结果见图3.5:
3.结果分析:
实验结果表明磷酸盐对产酸有极大影响。另外磷酸盐对谷氨酸生产菌的OD净增影响很大,随着磷酸盐浓度的升高,OD值净增增大,但产酸在达到最大值后下降。4
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图3.5磷酸氢二钠对产酸的影响
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、、.———_.
06o.09o.12o.】5o.18o21
磷酸氢二钠(%)
(三)钾盐对发酵的影响
钾不参与细胞结构物质的组成,它是许多酶的活性激活剂。1.材料和方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌¥9114
(2)培养基:葡萄糖2l%,尿素O.4%,玉米浆0.6%,糖蜜O|2
%,磷酸氢二钠0.09%,Fe2+2ppm,Mn2+2ppm,
VBll00ug/L,菌体水解液O.1%,氯化钾量为O.02%、0.06%、0.10%、0.14%,0.18%,0.22%,调节pH值7.0,装液量19ml/500ml三角瓶,1210C灭菌8分钟
(3)培养条件:将lml种子液接入发酵培养基中,置其于频率
为110次/分钟冲程为80mm的摇床上320c培养,根据实际情况逐级提温,并提高摇床频率。最后温度提至37~380C,摇床频率为120次/分钟,整个发酵过程用时38.5llr。
培养结束后取发酵液稀释100倍,用谷氨酸分析仪SBA-40C谷氨酸生成期对钾的需要量大于菌体增殖期的需要量。钾盐少时长菌体,钾盐足够时产酸,与生物素的作用正好相反。2.实验结果:测定,其结果见图3-6:
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图3.6氯化钾对产酸的影响
13,72
125
舌1268+GA%8
1156646—--—◆-—O—D62
116
002O060・10・140-180-22KCI
3.结果分析:
实验结果表明氯化钾浓度对产酸有所影响。随着钾盐浓度的升高,菌体的OD净增越来越少,产酸降低。适宜的氯化钾浓度既能够保证菌体增殖,也能保证菌体酶活。
五.微量元素对产酸的影响
有许多微量元素,微生物需要量十分微少,但又不可完全没有。例如锰是某些酶的激活剂,是羧化反应所必须的,在谷氨酸的生物合成途径中,草酰琥珀酸脱羧生成。一酮戊二酸是在Mn”的催化下完成的。Mn”有时还能替代Mg”的作用,参与氧化代谢,并与细胞膜的渗透性有关。铁是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶的组分,催化氧化还原反应,又是某些酶的激活剂。某些金属离子,特别是汞离子和铜离子,具有明显的毒性,抑制菌体生长并有害于谷氨酸的积累。
1.材料和方法:
(1)菌种:谷氨酸生产菌S9114
(2)培养基:葡萄糖2l%,尿素0.4%,玉米浆0.6%,糖蜜O.2
%,磷酸氢二钠0.09%,氯化钾0.06%,硫酸镁0.06%,玉米浆0.8%,Fe”2ppm,Mn”2ppm,VmlOOug/L,菌体水解液0.1%,aFc2+2ppm、Mn2+2ppm,bFe2+0、Mn2+2ppm,cFe2+2ppm、Mn2+0,dFe2+0、Mn2+0,调节pH值7.0,装液量19ml/500ml43
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三角瓶,121oC灭菌8分钟
(3)培养条件:
将lml种子液接入发酵培养基中,置其于频率为110次/分钟冲程为80mm的摇床上320C培养,根据实际情况逐级提温,并提高摇床频率。最后温度提至37~380C,摇床频率为120次/分钟,整个发酵过程用时38hr,流加40%尿素每次0.5ml。2.实验结果:
培养结束后取发酵液稀释100倍,用谷氨酸分析仪SBA--40C测定,其结果见表3-4:
表3-4金属离子对产酸的影响
培养基a培养基b培养基c培养基d
残糖(%)0.30.20.40.2兰墼(型!;:!!!:!!!:!!!:13.结果分析:
实验结果表明Mn2+和Fe2+的浓度对产酸没有显著影响。这是因为实验中用来配制培养基的水采用的是深井水,含有少量Mrl2+和Fe斗。实际生产中由于发酵罐是铁制成,完全可以不加Fe2+。
六.不同接种量对发酵的影响
1.材料与方法
(1)菌种:谷氨酸生产菌¥9114
(2)培养基:葡萄糖2l%,尿素0.4%,玉米浆O.6%,糖蜜0.2
%,磷酸氢二钠0.09%,氯化钾0.06%,Vml00ug/L,菌体水解液0.1%,a装液量18ml/500ml三角瓶加1.8ml水;b装液量18ml/500ml三角瓶加lml水;c装液量18ml/500ml三角瓶,调节pH值7.0,1200C灭菌8分钟(3)培养条件:将0.2m1种子液接入a发酵培养基中(接种量1
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%),将lml种子液接入b发酵培养基中(接种量5%),将2m1种子液接入C发酵培养基中(接种量10%),置其于频率为】05次/分钟冲程为80ram的摇床上320C培养,根据实际情况逐级提温,并提高摇床频率。最后温度提至37~380C,摇床频率为120次/分钟。
2.实验结果见表3.5:
表3-5:接种量对发酵周期的影响
3.结果分析:
实验结果表明大的接种量有利于缩短发酵时间,提高设备利用系数。对于产酸高低没有显著影响。
本部分小结:
通过实验,确定了双酶水解糖、尿素、混合生物素、无机盐、金属离子对发酵过程中菌体增殖和产酸的影响情况。还对种量等影响谷氨酸发酵的因素进行了研究,确立了大种量有利于缩短发酵时间,提高设备利用系数。
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乳矿
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致谢
本论文是在王玉萍教授和李翔太高工的悉心指导下完成的。三年来,王老师、李老师在学习上、生活上给予了诸多的关心和帮助,在此向二位老师致以最诚挚的谢意。
本论文的很多具体实验都是在菱花集团完成的,得到了王东洋部长、寇天萍主任、张远征所长的大力支持和帮助,特此表示衷心的感谢。
最后感谢所有关心、帮助和支持我的朋友。
王勇二零零二年五月
谷氨酸发酵工艺研究
作者:
学位授予单位:王勇山东大学
本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y434514.aspx