沙枣多酚响应面分析

超声波辅助提取沙枣多酚的工艺优化研究

1 材料、药品与仪器

沙枣于2008-2009年9月连续两年在甘肃古浪县腾格里沙漠随机抽取沙枣树50棵，用“几何法”采样后，缩小至1000g，在实验室经“四分法”采样到250 g，取核，粉碎过40目筛。

UV-9000紫外分光光度计（北京瑞丽分析仪器公司）、743型Rancimat仪（瑞士万通）、FD-1-55冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）、JY99-2D型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。DPPH·(二苯代苦味酰基自由基,SIGMA-ALDRICH.Inc)、Tannic acid（单宁酸标准品，SIGMA-ALDRICH.Inc）、Trolox (维生素E水溶性衍生物，SIGMA-ALDRICH,Inc)，Vc（维生素C）、磷钼酸、磷酸、无水乙醇、无水碳酸钠、钨酸钠等均为分析纯，BHT、TBHQ为食品级，NKA-9大孔吸附树脂购于南开大学化工厂。 2 试验方法

2.1 Folin-Dennis试剂制备[4]

在1000mL三角瓶中加入750mL蒸馏水，100g钨酸钠，20g磷钼酸，50mL磷酸后，在沸水浴中回流2h后，冷却至室温，并稀释至1000mL，即得Folin-Dennis试剂试剂。 2.2标准曲线的制作[5-7]

5mg单宁酸标准品溶于80%乙醇中，用水定容至10mL，即为0.5mg/mL的单宁酸标准溶液，分别移取0，20，40，60，80，100，120μL的单宁酸标准品于10mL容量瓶中，定容，从上面不同浓度的标准溶液中分别移取0.1mL放入10 mL容量瓶中，加入2mL蒸馏水，2.5mLFolin-Dennis试剂，用力摇匀，保持3min，加入5mL饱和Na2CO3溶液，用水定容至10mL。充分混匀，室温下保持1h，于760nm下测吸光值。每个浓度做 3个平行试验，取平均值，绘制标准曲线，得到吸光度值Y 与单宁酸标准溶液浓度X (mg／mL )之间

2

的回归方程为：Y=0.4566X+0.081，R=0.9999 2.3沙枣多酚含量的测定

采用超声波辅助溶剂浸提法。称取2.0000g沙枣样品，加入一定的乙醇溶液在一定超声功率下超声一定时间后在3500r/min 离心分离5min，然后定容至50mL。取样品溶液50μL到25mL容量瓶中，按照上述标准曲线的制作方法，测定其吸光度，计算样品中多酚含量。多酚含量（%）=样品中多酚质量（g）/样品质量（g）×100

2.4 响应曲面法试验设计

采用统计分析软件Design Expert 7.1.3软件进行4因素3水平的响应面分析试验。 2.6 沙枣多酚制备

在最优工艺条件下提取沙枣多酚后，浸提液离心除渣，上清液浓缩用NKA-9(树脂已经过筛选)大孔吸附树脂纯化，以去离子水洗涤除去水溶性杂质，再以50%乙醇洗脱得黄色乙醇洗脱液，减压蒸馏后冷冻干燥，得沙枣多酚。 3.1 单因素实验

3.1.1料液比对沙枣多酚含量的影响

乙醇浓度60%，超声10min，超声功率200W条件下做料液比对沙枣多酚含量的影响。由图1a可知, 随料液比的增大，多酚含量逐渐增大，当料液比为1:12时多酚含量达最高，说明此时多酚已提取完全，因此，取最佳料液比为1:12。

3.1.2超声时间对沙枣多酚含量的影响

乙醇浓度60%，超声功率为200W，料液比为1:12条件下研究超声时间对沙枣多酚含量的影响。由图1b可知，当超声时间为10min时，多酚含量最大，当超声时间大于10min时，随时间的增大多酚含量降低，另外，时间越长，耗能越大，所以取最佳超声时间为10min。 3.1.3乙醇浓度对沙枣多酚含量的影响

超声功率为200W，料液比为1:12，超声时间为10min条件下研究乙醇浓度对沙枣多酚含量的影响。 由图1c可知：多酚含量随乙醇浓度的增加而升高，当乙醇浓度在50%时，有较高的含量，当乙醇浓度大于50%，多酚含量降低。因为较高乙醇浓度有利于提高乙醇提取物含量，但高浓度乙醇使其他醇溶性杂质的溶出增多，多酚成分溶出减少，因此，最佳乙醇浓度取50%。 3.1.4超声功率对沙枣多酚含量的影响

以料液比1:12，超声时间为10min，乙醇浓度50%条件下做功率对沙枣多酚的影响。由图1d可知：随超声功率增大，多酚含量逐渐增大，当功率达280w以上时，超声功率增大多酚含量降低，因此，最佳超声功率为280w。

图1 Fig.1 Results of single factor experiments for Elaeagnus Angustifolia L . polyphenol

3.2 响应面优化试验

3.2.1 响应面实验设计及结果

根据单因素试验结果，选择超声功率、超声时间、料液比和乙醇浓度作响应面优化的试验点，分别以X1、X2、X3和X4表示。按方程χi＝(Xi －X0)/△X 对自变量进行编码，其中χi为自变量的编码值，Xi 为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长。χ1＝(X1－280)/40；χ2＝(X2－10)/5；χ3＝(X3－12)/2；χ4＝(X4－50)/10。实验因子、水平及编码表见表1。

表1试验设计因素和水平编码值

Table 1 Code and level of independent variable

因 素 水 平 -1 0 1

编码值

X1

超声功率/w

240 280 320 χ1

X2

超声时间/min

5 10 15 χ2

X3

-1

料液比/g·mL

1:10 1:12 1:14 χ3

X4

乙醇浓度/%

40 50 60 χ4

表2 Box-Behnken实验设计及结果 Table 2 Design and results of experiment

试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

X1 -1 1 -1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

X2 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0

X3 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

X4 0 0 0 0 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0

多酚含量Y /%

5.63 7.54 7.59 7.82 6.56 6.93 6.41 7.54 6.42 8.67 7.72 7.30 6.02 8.04 6.77 7.46 6.46 7.44 8.44 7.39 6.71 7.97 7.29 7.66 8.50 8.38 8.84 8.36 8.83

3.2.2 模型方差分析

表2 为29个试验点给出的试验结果，试验号1-24为析因试验，试验号25-29为中心试验。29个试验点分为2类：其1是析因点，自变量取值在所构成的三维顶点，共有24个析因点；其余是区域中心点， 零点试验重复5次，用以估计实验误差，以多酚含量为响应值(Y)。运用Design Expert 7.1.3软件进行二次多元回归拟合，得到表3回归方程模型方差分析。

表3 回归模型的方差分析

Table 3 Variance analysis of regression model

方差来源 模型 X1 X2 X3 X4 X1X2 X1X3 X1X4 X2X3 X2X4 X3X4 2X1 2X2 2X3 2X4 残差 失拟 纯误差 总和

平方和 18.79 1.04 4.02 1.08 0.036 1.03 1.03 1.80 0.44 0.20 0.15 1.31 3.08 4.84 2.74 2.03 1.80 0.23 20.82

自由度 14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 10 4 28

均方 F 1.34 9.26 1.04 7.17 4.02 27.74 1.08 7.43 0.036 0.25 1.03 7.12 1.03 7.13 1.80 12.39 0.44 3.07 0.20 1.37 0.15 1.02 1.31 9.07 3.08 21.26 4.84 33.38 2.74 18.88 0.14 0.18 3.16 0.057 22

R=0.9026，RAdj=0.8051

Prob＞F

0.1393

注：*差异显著(p＜0.05)；**差异高度显著(p＜0.01)；***差异极显著(p＜0.001)。

由表3方差分析可看出，回归模型达到极显著，二次多元回归模型成立，应用此方程可以预测多酚含量及优化提取工艺。其决定回归系数R2=0.9026，表明从统计学意义讲，该回归方程可以代替真实试验点对试验结果进行分析。从另一种意义上讲，这种实验方法是可靠的。

由表3还可知，一次项X2和二次项X22、X32、X42对多酚含量的影响都极显著，二次项X12和交互项X1X4对多酚的影响高度显著，一次项X1 、X3和交互项X1X2、X1X3对多酚的影响显著。由表还可看出，影响多酚含量的因素主次为：超声时间＞料液比＞超声功率＞乙醇浓度。

对模型拟合得二次多项回归方程：Y(%)=8.58+0.29χ1+0.58χ2+0.3χ3+0.055X4－0.51χ1χ2－0.51χ1χ3－0.67χ1χ4－0.33χ2χ3－0.22χ2χ4+0.19χ3χ4－0.45χ12－0.69χ22－0.86χ32－0.65 χ42 3.2.3 响应面分析及工艺优化

图2 超声功率和超声时间交互作用的响应面及等高线图

Fig.2 Effec to ultrasonic power and extraction time on ultrasonic extraction

通过多酚含量回归方程所作的响应面图和等高线图见图2-4。由图2可知，超声时间较短时，随着超声波处理功率的增大，多酚含量一直呈现增大趋势，并最后趋于恒定值；超声波处理时间较长时，多酚含量随着超声波功率的增大而呈现出先增大后减小的趋势；在较低超声功率处理时，随着处理时间的延长多酚含量呈现增大趋势；当超声波功率较大，随着超声波处理时间的延长，多酚含量先增大后减小。

图3 超声功率和料液比交互作用的响应面及等高线图

Fig.3 Effec to ultrasonic power and the raito of solid to liquid on ultrasonic extraction

由图3可看出，超声波功率较低时，随着料液比的增大，多酚含量呈现先增大后减小的趋势；超声波功率较高时，随着料液比的增大，多酚含量呈现先增大后减小的趋势；料液比较小时，随着超声波功率的增大多酚含量呈现增大的趋势并趋于平缓；料液比较大时，多酚含量随功率的增大呈现先增大后减小的趋势。在图4 中，乙醇浓度较低时，随着超声功率的增大，多酚的含量逐渐增大并趋于平缓；乙醇浓度较高时，多酚的含量随着超声功率的增大而呈现出先增大后减小的趋势；较低超声功率处理时，随着乙醇浓度的增加，多酚的含量也随着增加并逐渐趋于平缓；当超声功率较大时，随着乙醇浓度的增加，多酚含量先增大后减小。综合以上分析，以上交互因素的响应面趋势呈抛物线形，最佳作用点均落在试验范围之内，因此回归方程有极大值。

图4 超声功率及乙醇浓度交互作用的响应面及等高线图

Fig.4 Effec to ultrasonic power and concentration of ethanol on ultrasonic extraction

为了进一步确定最佳点的值，对回归方程取一阶偏导数等于零并整理得：

0.29－0.51χ2－0.51χ3－0.67χ4－0.9χ1=0 ⑴ 0.58－0.51χ1－0.33χ3－0.22χ4－1.38χ2=0 ⑵ 0.30－0.51χ1－0.33χ2+0.19 χ4－1.72χ3=0 ⑶ 0.055－0.67χ1－0.22 χ2+0.19χ3－1.34χ4=0 ⑷ 式⑴、式⑵、式⑶、式⑷联立方程组，求解得χ1=0.7337；χ2 =－0.0587；χ3=－0.302；χ4=－0.1905，代入前述的变换公式得到：X1 =309.348；X2 =9.7065；X3 =11.396；X4 =48.095；即多酚提取的最佳工艺为：超声功率309.348w；超声时间9.707min；料液比1:11.396；乙醇浓度48.095%，在此条件下进行实验，由回归方程预测水解度的理论值可达到10.098%。 2.2.3 2．4 紫苏叶多酚提取工艺条件

结合二次回归模型的数学分析结果，超声波辅助提取紫沙枣多酚的最佳工艺参数为：超声功率309.348w；超声时间9.707min；料液比1:11.396；乙醇浓度48.095%，在此条件下，响应面最佳条件多酚含量预测值8.582%，多酚含量响应值8.477%，多酚含量与预测值接近，因此进一步验证了实验结果，说明该模型可以较好地反应多酚提取工艺的优化条件。 参考文献:

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根据单因素试验结果，选择超声功率、超声时间、料液比和丙酮浓度作为响应面优化的试验点，分别以X1、X2、X3和X4表示。按方程χi＝(Xi －X0)/△X 对自变量进行编码，其中χi为自变量的编码值，Xi 为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长。χ1＝(X1－280)/40；χ2＝(X2－10)/5；χ3＝(X3－12)/2；χ4＝(X4－50)/10。实验因子、水平及编码表见表1。

表.1试验设计因素和水平编码值 X1 X2 X3 X4

因 素

超声功率（w） 超声时间(min) 料液比(g/ml) 丙酮浓度(%) -1 240 5 1:10 40 水

0 280 10 1:12 50 平 1 320 15 1:14 60

χ1 χ2 χ3 χ4 编码值

12341 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

-1 1 -1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

-1 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0

0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0

8.38 8.36 8.72 9.75 9.27 9.28 8.63 10.88 8.01 12.22 10.20 9.64 9.74 9.09 10.06 10.31 8.81 10.10 9.20 9.97 9.26 10.33 9.93 10.31 12.02 12.02 12.41 12.58 12.71

试验号 1 2 3

X1

输入原来数据 排列不变

X2

X3

X4

Y (%)

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2.2 模型方差分析

表2 为29个试验点给出的试验结果，试验号1-24为析因试验，试验号25-29为中心试验。29个试验点分为2类：其1是析因点，自变量取值在所构成的三维顶点，共有24个析因点；其余是区域中心点， 零点试验重复5次，用以估计实验误差，以单宁得率为响应值(Y)。运用Design Expert 6.0软件进行二次多元回归拟合，得到表3回归方程模型方差分析。

表3 回归模型的方差分析

方差来源 平方和 自由度 均方 模型

X1 X2 X3 X4 X1X2 X1X3 X1X4 X2X3 X2X4 X3X4 X12 X22 X32 X42 残差 失拟 纯误差 总和

46.21 3.76 0.64 1.37 0.12 0.28 0.068 5.69 0.20 0.12 1.25 16.7 14.52 11.97 6.90 5.19 4.79 0.4 51.4

14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 10 4 28

F

Prob＞F

3.30 8.90 0.0001*** 3.76 10.14 0.0066** 0.64 1.74 0.2088 1.37 3.70 0.0749 0.12 0.33 0.5723 0.28 0.74 0.0403* 0.0

0.180 0.6760

68

5.69 0.15.33 0.0016** 0.20 0.55 0.4722 0.12 0.32 0.5801 1.25 3.38 0.0087** 16.7 45.10 ＜0.0001*** 14.52 39.13 ＜0.0001*** 11.97 32.27 ＜0.0001*** 6.90 18.59 0.0007*** 0.37 0.48 0.10

4.47

0.0735

R2=0. 9298，R2Adj=0. 8687

注：*差异显著(p＜0.05)；**差异高度显著(p＜0.01)；***差异极显著(p＜0.001)。

由表3方差分析可看出，回归模型达到极显著，二次多元回归模型成立，应用此方程可以预测单宁提取率的得率及优化提取工艺。其决定回归系数R2=0.9898，表明从统计学意义讲，该回归方程可以代替真

实试验点对试验结果进行分析。从另一种意义上讲，这种实验方法是可靠的。

由表3还可知，一次项X1和二次项X12、X22、X32、X42对单宁得率的影响都极显著，交互项X1X4 和X3X4对单宁得率的影响高度显著，交互项X1X2对单宁得率的影响显著。由表还可看出，影响单宁得率的因素主次为：超声功率＞料液比＞超声时间＞丙酮浓度。

对模型拟合得二次多项回归方程：Y(%)=12.35+0.56χ1+0.23χ2+0.34χ3+0.10X4 +0.26χ1χ2－0.13χ1χ3－1.19χ1χ4+0.23χ2χ3－0.17χ2χ4 + 0.56χ3χ4－1.61χ12－1.50χ22－1.36χ32－1.03 χ42 2.2.2 响应面分析及工艺优化

通过得率回归方程所作的响应面图和等高线图见图1～3。由图1可知，丙酮浓度较低时，随着超声功率的增大，单宁提取率逐渐增大并趋于平缓；丙酮浓度较高时，单宁提取率随着超声功率的增大而呈现先增大后稍微减小的趋势；较低超声功率处理时，随着丙酮浓度的增加，单宁提取率也随着增加；当超声功率较大时，随着丙酮浓度的增加，单宁提取率逐渐增大并趋于平缓。由此可见，适当增加超声波功率和丙酮浓度，可以提高单宁的提取率。

图1 超声功率和丙酮浓度交互作用的响应面及等高线图

图2 料液比和丙酮浓度交互作用的响应面及等高线图

图3 超声功率及时间交互作用的响应面及等高线图

由图2可看出，丙酮浓度较低时，随着料液比的增大，单宁提取率呈现先增大后减小的趋势；丙酮浓度较高时，随着料液比的增大，单宁提取率呈现减小的趋势；料液比较小时，随着丙酮浓度的增大单宁提取率呈现增大的趋势并趋于平缓；料液比较大时，单宁提取率随丙酮浓度的增大呈现先增大后减小的趋势。在图3 中，超声功率及时间对单宁得率的影响与图2 相似，因此应慎重控制超声功率、超声时间、料液比及丙酮浓度，以期获得较高的提取率。综合以上分析，以上交互因素的响应面趋势呈抛物线形，最佳作用点均落在试验范围之内，因此回归方程有极大值。

为了进一步确定最佳点的值，对回归方程取一阶偏导数等于零并整理得： 0.56+0.26χ2－0.13χ3－1.19χ4－3.22χ1=0 ⑴ 0.23+0.26χ1+0.23χ3－0.17 χ4－3.0χ2=0 ⑵ 0.34－0.13χ1+0.23χ2+0.56χ4－2.73χ3=0 ⑶ 0.10－1.19χ1－0.17 χ2+0.56χ3－2.06χ4=0 ⑷ 式⑴、式⑵、式⑶、式⑷联立方程组，求解得χ1= 0.170；χ2 = 0.104；χ3=0.120；χ4=0.016，代入前述的变换公式得到：X1 =286.8；X2 =10.52；X3 =12.24；X4 =50.16；即单宁提取的最佳工艺为：超声功率286.8w；超声时间10.52min；料液比1:12.24；丙酮浓度50.16%，在此条件下进行实验，由回归方程预测水解度的理论值可达到12.253%。 2.2.3 验证试验

为检验响应面分析法的可靠性，采用上述最优工艺条件根据最佳工艺条件，做三组验证性实验，结果如表4 所示。

表4 最佳工体条件验证结果

1 2 3 试验号 平均值 单因素最佳条件得率

响应面最佳得率(%)

由表4可以看出，在最佳工艺条件下，单宁的得率与预测值接近，因此进一步验证了实验结果，说明该模型可以较好地反应单宁提取工艺的优化条件。

由表7可以看出，四因素对沙枣单宁的提取影响大小依次为：超声时间>料液比>超声功率>丙酮浓度，说明超声提取时，提取时间对沙枣单宁提取率的影响最大。