官厅水库生物固氮作用对水体富营养化的响应
第４１卷第４期吉林大学学报（地球科学版）
Ｖ０１．４１Ｎｏ．４
２０１１年０７月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＥａｒｔｈＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）
Ｊｕｌｙ２０１Ｉ
官厅水库生物固氮作用对水体富营养化的响应
孙寓姣，陈
程，丁爱中，程莉蓉
北京师范大学水科学研究院。北京１００８７５
摘要：以官厅水库富营养化水体为研究对象，利用乙炔还原法测量水体生物固氮能力，结合变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术对固氮生物ｎｉｆＨ基因进行分析。实验结果表明，官厅水库水体存在生物固氮现象，
固氮速率为０．１７２～９．３５ｎｍｏｌ／（ｍａ・ｄ），与水体氨氮、总氮、总磷呈显著相关性（Ｐ一０．９９８，ｒ＝０．０００；Ｐ一
０．９８６，ｒ＝０．０００；Ｐ＝０．９６８，ｒ一０．００２）。ＤＧＧＥ图谱显示：各点固氮细菌丰度差异较大，Ｓｈａｎｎｏｎ—Ｗｅａｖｅｒ
指教为０．８０～２．４５，固氮细茼丰度和总氮、总磷存在较强相关性（Ｐ＝０．７３７，，．＝０．０９４；Ｐ＝０．７８７，
ｒ＝０．０６３）。随着水体富营养水平的上升，固氮微生物多样性急剧增加，水体固氮能力也随之上升。自然
固氮可能对原本富营养化的水体产生更大危害。
关键词：官厅水库；生物固氮；富营养化；聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳
中图分类号：
文献标志码：Ａ文章编号：１６７１—５８８８（２０１１）０４—１１７９一０７
ＲｅｓｐｏｎｓｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＮｉｔｒｏｇｅｎＦｉｘａｔｉｏｎｔｏＥｕｔｒｏｐｈｉｃ
Ｗａｔｅｒ
ｉｎＧｕａｎｔｉｎｇＲｅｓｅｒｖｏｉｒ
ＳＵＮＹｕ－ｊｉａｏ，ＣＨＥＮＣｈｅｎｇ，ＤＩＮＧＡｉ－ｚｈｏｎｇ，ＣＨＥＮＧＬｉ—ｒｏｎｇ
Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ
ＷａｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ
Ｎｏｒｍａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＢｅＱｉｎｇ
１００８７５，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ
Ｇｕａｎｔｉｎｇｒｅｓｅｒｖｏｉｒ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｆｉｘａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ（ＮＦＲ）ｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄ
ｗｉｔｈ
ａｃｅｔｙｌｅｎｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＦＢ）ｗａｓｒｅｖｅａｌｅｄｗｉｔｈｎｉｆＨ
ｇｅｎｅＰＣＲ—ＤＧＧＥｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｅｘｉｓｔｓｉｎＧｕａｎｔｉｎｇ
ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ，ｔｈｅ
ｒａｔｅｓ
ｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．１７２
ｔｏ
９．３５ｎｍｏｌ／（ｍ３・ｄ）．Ｔｈｅｒｅｗａｓ
ａ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＮＦＲａｎｄ
ＮＨ，一Ｎ（Ｐ－－－０．９９８，，．＝０．ｏｏｏ），ＴＮ（Ｐ一０．９８６，ｒ一０．ｏｏｏ），ＴＰ（Ｐ＝
０．９６８，ｒ一０．００２）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＤＧＧＥｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅ（ＮＦＢ）ａｂｕｎｄａｎｃｅｄｉｆｆｅｒｅｄｂｅｔｗｅｅｎｓｉｘｓｉｔｅｓａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎＮＦＢａｂｕｎｄａｎｃｅａｎｄＴＮ（Ｐ＝
０．７３７，ｒ＝０．０９４），ＴＰ（Ｐ一０．７８７，ｒ＝０．０６３）．Ｓｈａｎｎｏｎ—Ｗｅａｖｅｒ
ｉｎｄｅｘｖａｒｉｅｄｉｎ
ａ
ｒａｎｇｅｏｆ０．８０—
２．４５．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｅｕｔｒｏｐｈｉｃａｔｉｏｎｉｎｒｅｓｅｒｖｉｏｒ，ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉａｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｕｔｒｉｅｎｔ
ｓｔａｔｕｓ
ａｎｄｔｈｅｒｅｂｙＮＦＲｅｎｈａｎｃｅｄ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｆｉｘａｔｉｏｎｃｏｕｌｄ
ａｇｇｒａｖａｔｅｅｕｔｒｏｐｈｉｃａｔｉｏｎｉｎＧｕａｎｔｉｎｇｒｅｓｅｒｖｏｉｒ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｇｕａｎｔｉｎｇｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎ；ｅｕｔｒｏｐｈｉｃａｔｉｏｎ；ＰＣＲ—ＤＧＧＥ
收稿日期：２０１０—０９—０８
基金项目：国家自然科学基金项目（５０７０８００８）
作者简介：孙寓姣（１９７５－－），女，黑龙江哈尔滨人，副教授，主要从事环境生物技术和污染环境微生物学方面的研究，Ｅ．
ｍａｉｌ：ｓｕｎｙｕｊｉａｏ＠ｂｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通信作者：丁爱中（１９６９－－）．男，安徽怀宁人。教授，博士生导师，主要从事水污染控制、水生态与环境修复研究，Ｅ．
ｍａｉｌ：ａｄｉｎｇ（孕ｂｎｕ．ｅｄｕ．ａｎ。
万方数据
吉林大学学报（地球科学版）
第４１卷
０引言
ｓ４，Ｓ５，Ｓ６位于水库库区。采样中使用ＧＰＳ系统对每个采样点进行精确定位，采样点位置见图１。
官厅水库位于北京市西北部，曾是北京市主要
饮用水源地之一。自２０世纪８０年代以来，官厅水
库水体严重富营养化，并且在夏季会发生严重的铜绿微囊藻水华［１］，因而官厅水库于１９９７年退出北京市饮用水体系∞引。于勇勇“］利用主成分分析法对
官厅水库１９９０—１９９９年１０个监测断面的水质数
据进行了分析，结果显示，氨氮（ＮＨ≯一Ｎ）、总氮（ＴＮ）、总磷（ＴＰ）是官厅水库富营养化的主要贡献因子。近年来，由于北京市饮用水需求量的增加，饮用水短缺问题日益严重，官厅水库的水体修复成为亟待解决的问题之一。水体氮营养元素的来源主要有人为源及天然源，目前针对官厅水库氮素人为来０官厅镇
源的研究很多［５刮，但是对其天然来源的研究则很图１官厅水库采样点圈
少。已有研究表明：生物固氮作用在氮素的自然循Ｆｉｇ．１
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
ｏｆｓａｍｐｌｉｎｇｓｉｔｅｓｉｎＧｕａｎｔｉｎｇｒｅｓｅｒｖｏｉｒ
环中扮演着重要角色，它甚至是很多氮限制水体（例如海洋和贫营养湖泊）中氮素的重要来源［７ｑ引。在用有机玻璃采样器采集水深０．５ｍ左右处水一些富营养湖泊中，固氮蓝藻也会成为优势种口’１５１。
样。用于测定固氮速率的水样注入经盐酸浸泡洗对水体固氮细菌群落结构的研究，是弄清微生净、水样反复润洗的玻璃瓶中，低温条件下避光带回物固氮作用过程的基础。利用传统分离培养方法，实验室；用于基因组ＤＮＡ提取的水样，注入洗净灭仅能获取环境中不到１％的细菌类群［１引，不利于了菌后的玻璃瓶中低温带回实验室；其它水样用预先解环境微生物的真实存在状况。利用分子生物学手洗净的聚乙烯采样瓶采集，低温带回实验室检测。段进行微生物生态学研究，大大提高了对实际环境１．２水样分析
中微生物多样性的全面认识，聚合酶链式反应
１．２．１
水体固氮速率测定
（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ，简称ＰＣＲ）和变性梯度
水样经过浓缩后，采用乙炔还原法测定水体固凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ
ｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏ－ｐｈｏｒｅｓｉｓ，
氮速率［１８－２１］。具体过程如下：取１５０ｍＬ水样经定简称ＤＧＧＥ）技术的联合使用，使得环境微生物分性滤纸过滤除去悬浮颗粒物，再用０．２２ｐｍ孔径纤子生态学研究向前迈进了一大步。１９９３年Ｍｕｚｙｅｒ维滤膜过滤去除藻类及微生物待用；另取ｌ
５００ｍＬ
等［１７］首次将ＰＣＲ—ｉ）ＧＧＥ技术应用于微生物生态水样在８５００×ｇ力、４℃条件下离心２０ｍｉｎ以沉降学研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群藻类及微生物细胞；弃上清液，用１５０ｍＬ经过滤处落遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。
理的水样重悬浮，即将水样浓缩１０倍；取浓缩后的笔者应用乙炔还原法测量官厅水库水体的生物水样５０ｍＬ，注于６５ｍＬ磨口三角瓶中，用注射器
固氮能力，同时利用ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术对官厅水库抽取顶端１５％的空气，并注入等量乙炔气体；水样
不同区域水体固氮细菌群落结构变化进行了研究，在２７。Ｃ培养箱中水浴培养７２ｈ，加入０．１
ｍＬ
５０％
以期发现官厅水库水体固氮微生物固氮能力及其群三氯乙酸（ＴＣＡ）［ｚ２］后终止反应；取１００“Ｌ顶端气落结构对富营养化水平的响应。
体，用ＳＰ一２１００型气相色谱检测乙炔含量，换算成ｌ材料与方法
氮含量表示固氮速率。每个采样点均设置３组平行样，同时用无菌水设置３组对照实验。
１．１水样采集
１．２．２
总ＤＮＡ提取及固氮ｎｉｌＨ基因扩增
水样于２００９年７月２０日采自官厅水库，采样
水样在无菌条件下经０．２２弘ｍ孔径醋酸纤维
时水库库区发生严重水华。共设６个采样点（Ｓ１一
素滤膜过滤，生物样品浓缩于滤膜上，滤膜置于Ｓ６），其中，Ｓｌ，Ｓ２，Ｓ３位于官厅水库上游妫水河，
－－２０℃条件下保存。使用ＯｍｅｇａＷａｔｅｒ
ＤＮＡＫｉｔ
万方数据
第４期孙寓姣，等：官厅水库生物固氮作用对水体富营养化的响应
试剂盒按其操作说明提取水体微生物的总ＤＮＡ。ｐｏｗｅｒＬｏｏｋ
２１００ＸＬ）。随后使用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软
利用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
件对ＤＧＧＥ图谱进行分析，分析各泳道条带数目及本研究使用巢式ＰＣＲ对固氮ｎｉｆＨ基因进行扩灰度。ｎｉｆＨ基因的多样性使用Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｅａｖｅｒ指增，所用的外引物为ＦＧＰＨｌ９和ＰｏｌＲ，内引物为
数Ｈ［２４１进行表征。计算公式为
ＧＣ—ＰｏｌＦ和ＡＱＥＲ［２３。。ＰＣＲ反应液含有：１“Ｌ已
Ｓ
提取的ＤＮＡ样品，５．０ｔｔＬ
１０Ｘ
ＰＣＲ缓冲液
Ｈ＝一＞：Ｐｆ・ＩｎＰｆ。
ｆ＝ｌ
（Ｔａｋａｒａ公司），４．０“Ｌ
２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ．ｄＮＴＰ混合液
式中：Ｐ；为每条泳道中第ｉ条条带灰度占该样品总（Ｔａｋａｒａ公司），２０ｍｍｏｌ／Ｌ上下游引物各１“Ｌ，
灰度的比率；Ｓ为泳道中含有的条带总数目。０．２５ｔｔＬ（０．５
Ｕ／ｔｔＬ）Ｔａｑ聚合酶（Ｔａｋａｒａ公司），添
１．２．４水体理化参数的测定
加无菌水将反应液补齐至５０肚Ｌ。ＰＣＲ扩增条件水温、ｐＨ和溶解氧（ＤＯ）质量浓度现场测定；为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性６０Ｓ，５４℃退火６０水质理化指标当天送至北京谱尼测试公司测定，包Ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共进行３０个循环；最后７２℃延括ｐ（ＮＨ产一Ｎ），Ｐ（Ｎ０３一Ｎ），Ｐ（ＴＮ），Ｐ（ＴＰ），伸７ｍｉｎ。使用无菌水替代ＤＮＡ作为阴性对照。
ｐ（ＢＯＤ５），ｐ（ＣＯＤ。），ｐ（Ｆｅ）等；叶绿素ａ（Ｃｈｌ—ａ）质第一轮ＰＣＲ反应结束后取１弘Ｌ产物为模板，量浓度的测定在北京理化测试中心完成。使用内引物进行第二轮扩增。第二轮ＰＣＲ反应的１．３．５数据处理
反应液与第一轮组成基本一致，只是将第一轮反应所有实验数据均在ＳＰＳＳｆｏｒ
Ｗｉｎｄｏｗｓ（１５．ｏ）
体系中５．０弘Ｌ的１０×ＰＣＲ缓冲液换成２５弘Ｌ的２统计软件上进行处理。
×ＧＣＰＣＲ缓冲液，添加无菌水将反应液补齐至总２
结果
体系５０肛Ｌ。第二轮ＰＣＲ扩增条件为：９４℃预变性
５
ｍｉｎ；９４℃变性６０Ｓ，５６℃退火６０Ｓ，７２℃延伸２
２．１各采样点水质及营养状态
ｍｉｎ，共进行３０个循环；最后７２℃延伸７ｍｉｎ。使官厅水库６个采样点主要的理化指标及水质参用无菌水替代第一轮ＰＣＲ产物作为阴性对照。第数如表１所示。官厅水库夏季表层水温为２５．３～二轮产物用１．２％琼脂糖电泳进行检测，用Ｏｍｅｇａ２６．３℃，平均ｐＨ为８．７２，６个采样点ｐ（ＤＯ）变化ＰＣＲ产物纯化试剂盒对ＰＣＲ条带进行切胶回收。
较大，最大值（７．４８ｒａｇ／Ｌ）在Ｓ１处测得，最小值
１．２．３
ｎｉｌＨ基因扩增片段的ＤＧＧＥ分析
（５．８４
ｍｇ／Ｌ）在Ｓ５处测得。水质在妫水河流域和
固氮ｎｉｆＨ基因扩增片段通过ＤＧＧＥ分离来研水库库区存在明显差异，库区ｌＤ（ＢＯＤｓ），ＪＤ（ＣＯＤ。，）究固氮微生物多样性。聚丙烯酰胺的变性梯度范围远高于妫水河。氮、磷质量浓度也存在同样的变化为３５％～６５％，ＤＮＡ扩增产物上样量约为２００
ｎｇ，
趋势，库区水体富营养状态比妫水河严重。库区
在６０℃恒温、８０Ｖ恒压条件下，电泳１３～１５ｈ。电ｓ４一Ｓ６的ｐ（Ｃｈｌ—ａ）严重超标，其中Ｓ５处ｐ（Ｃｈｌ—
泳完毕后采用银染技术染色，白光成像（ｕｍａｘ
ａ）高达１９６ｍｇ／ｍ３。
袭１官厅水库采样点水质指标
Ｔａｂｌｅ１
Ｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄ
ｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓａｍｐｌｉｎｇｓｉｔｅｓｉｎＧｕａｎｔｉｎｇｒｅｓｅｒｖｏｉｒ
万方数据
占林大学学报（地球科学版）第４１卷
２．２各采样点固氯速率左右，适用于进行ＤＧＧＥ分析。
６个采样点均检测出固氮速率，平均固氮速率
为１．９９ｎｍｏ［／（ｍ３・ｄ），所有对照组均未测得。这
表明．在水华发生的季节官厅水库确实存在生物固氮现象。从图２可知，各采样点固氮速率差异性很大，在富营养水平较高的水库库区，固氮水平较高，其中水华爆发的采样点ｓ５处固氮速率最高，达到
９．３５
０．１７２
ｎｍｏｌ／（ｍ３・ｄ）；相比之下，固氮速率的最小值ｎｍｏｌ／（ｍ３・ｄ）出现在ｓ３处，该处为富营养
化水平较低的妫水河流域。用ＳＰＳＳ软件分析固氮速率和采样点氨氮、总氮、总磷的相关性分别为Ｐ一
０．９９８，ｒ－－０．０００；Ｐ一０．９８６，ｒ一０．０００；Ｐ＝０．９６８，ｒ
图３官厅水库各采样点ｎｉｆＨ基因ＰＣＲ扩增图谱
Ｆｉｇ．３
ＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ
ｎｉｆＨ
ｇｅｎｅ
ｉｎ
Ｇｕａｎｔｉｎｇ
一０．００２，表明固氮速率跟三者之间有显著的正相关
性。
ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ
２．４各采样点固氮细菌ＤＧＧＥ结果
ｉ
８６
１２，
巢式ＰＣＲ对固氮ｎｉｆＨ基因产生了较好的扩增效果（图３）。产物经ＤＧＧＥ分析后，指纹图谱见图４。泳道中条带数目代表各采样点固氮微生物丰度。由图可见，６个采样点形成了数目不同的条带，且条带的亮度和迁移速率不同，表示官厅水库不同地点固氮微生物丰度差异性大。ＤＧＧＥ图谱中６个采样点分别形成了６，６，３．１４，１５，８条条带。并且随着水体富营养化程度的加重，条带数量呈逐步增加的趋势，从水质良好的妫水河区域到富营养的水库库
区，ｎｉｆＨ基因的ＤＧＧＥ条带数量从３条（Ｓ３）增加
“），
ｓ６
１
ｌ
４≤
一．．１∞山１＼《
二篓
４：
ＳＩ
Ｓ２
。季
．２一
∞
Ｓ４Ｓ５
舶
采样点
图２官厅水库采样点水质与固氯速率关系
Ｆｉｇ．２
Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ
ＮＦＲａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｓｔａｔｅｓｉｎ
到１５条（ｓ５）。从ＤＧＧＥ条带的亮度变化可以看到，有一种绝对优势固氮在６个采样点中都可以找到，但在富营养化程度严重的水库库区．叉出现了一些新的优势种群。结合表１和图４可看出：随着富营养程度的增加，同氮微生物的种类逐渐增多，在富营养化最严重的ｓ５处．固氮微生物的丰度达到最大值。分析各点固氮微生物丰度和营养物质浓度的相关性，发现固氮物种丰度和总氮浓度的相关性为Ｐ
＝０．７３７，ｒ一０．０９４，总磷的相关性为Ｐ一０．７８７．ｒ一
Ｇｕａｎｔｉｎｇｒｅｓｅｒｖｏｉｒ
２．３水样ＤＮＡ的提取及ｎｉｆＨ基因ＰＣＲ扩增
为了增加ＤＮＡ的提取效率，在使用试剂盒提取水体ＤＮＡ样品的过程中增加了机械力细胞破碎的步骤，同时利用反复冻融以及增加水浴温度、时间等方法使水体微生物ＤＮＡ尽量多地释放出来。提
取出的ＤＮＡ样品经过ｌｔ２％的琼脂糖凝胶电泳检验，片段长度均在２３ｋｂ左右。使用核酸蛋白测定仪测定产物在２６０ａｍ、２８０ａｍ紫外波长下的吸光
０．０６３，表明丰度和二者均有一定的正相关性，但总磷对固氮物种丰度的影响更为显著。
用Ｈ计算各采样点固氯微生物多样忭结果显
示，Ｈ的数值为０．８０～２４ｊ，表ｆ｛爿各采样点固氮微
度，两者比值为１．６～１．８，达到ＰＣＲ扩增所需条
件。
对提取的ＤＮＡ进行固氮ｎｉｆＨ基因扩增。采取巢式ＰＣＲ扩增方法，大大提高了扩增的特异性。
经２次ＰＣＲ扩增后．对最终产物进行切胶纯化回
生物多样性差别较大。最小俩出现在ｓ３处．最大值出现在ｓ５处．表明ｓｊ处的固氮微牛物多样性最高。图５足ＤＧＧＥ指纹图潜的聚类分析结果．由图町知：ｓ１．ｓ２．ｓ３三个采样点的Ⅲ氮微生物群落相似性高，ｓ４和ｓ６之间的相似性也很高；『『Ｉｉｓ５点则具有
收，保证了ＤＧＧＥ结果的准确性。用１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出的ＤＮＡ片段大小为３４０
ｂｐ
万方数据
第４期孙寓妓．等：宵ｒ『水库生物圊氯作用对水体富营养化的响应
独特的群落结构，它和Ｓ４、Ｓ６的相似性指数为氨氮、硝态氮的条件下，固氮速率较高”。２７１；此外．０．４５，和ｓ１．ｓ２．Ｓ３的相似性仅为０．３２。
较高的磷浓度，低的氮磷比值，以及水体中铁的存在也能增加生物的固氮速率２””。
和其他贫营养化湖泊比较而吉，官厅水库水体固氮速率相对较低。””。。这是因为在贫营养水体中，氮素是微生物生长的限制因素．生物固氮足水体氮营养的重要来源，而官厅水库氮素严蕈超标．氮元素不是生物生长的限制因素，因此微生物的阎氮作用较小。文献表明，在一砦贫营养的湖泊中，固氮鱼腥藻属容易形成水华以应对水体巾氮素的短缺【“。此情况下，固氮速率的大小和水体氨氮质量浓度一般呈负相关性．冈为氨氮的存在会对ｌ州氮酶
的合成产生抑制作』＂。而在本次研究中．官厅水库
６个采样点氨氮对固氮速率并没有明显的抑制作用，而是与水体氨氮质量浓度呈现很强的正相关性；结合ＤＧＧＥ分析结果，营养程度高的采样点固氮微生物种类的大量增加可能是原因之一。另外，固氮
酶的活性中心足由钼铁蛋白组成，因此铁对微生物
同氮行为十分重要＿…］。对官厅水库水体铁质量浓
度的测定结果显示，铁离子质量浓度随着固氮速率的增加而减小，最低值（０．０２６ｍｇ／Ｌ）出现在固氮速
率最高的Ｓ５点处。其原因可能是在固氮速率越大的地点．生物固氮酶合成的速度越高，因此消耗的铁
含量就越多“。
３．２
固氮微生物群落和固氮速率
运用ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术分析细菌多样性．从而表征环境中微生物的种群比传统培养技术有很大优
闰４官厅水库采样点ＤＧＧＥ指纹图谱
势；虽然ＤＧＧＥ方法只能对微生物群落中数量大干
Ｆｉｇ．４
—
ＤＧＧＥｂａｎｄ
ｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｎｉｆＨｇｅｎｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇ
ｔｈｅｔｏｔａｌ
ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ
１％的优势种群进行分析“…，且过程中还存在一些不确定因素”。，但是到目前为止．ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术仍然是研究环境中微生物群落变化的理想工
Ｓ５具…。
Ｓ６Ｓ４对富营养程度不同的水体细菌多样性变化的研Ｓ１究很多。”“１，但针对闶氮细菌多样性变化进行的研Ｓ３究则较少。冯胜等ｏ“运ＪｆＪｔＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术研究Ｓ２
太湖细菌群落结构对水体富营养化响应时发现：随圈５官厅水库采样点ＤＧＧＥ图谱聚类分析
着富营养程度的上升．水体细菌的多样性降低，且优Ｆｉｇ．５
ＵＰＧＭＡｃｈｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＤＧＧＥｐｒｏｆｉｌ８
势种数日减少；这可能足由于蓝藻爆发产生的藻毒素抑制ｒ某些细菌的生长。在本研究中，利用ＰＣＲ
３讨论
ＤＧＧＥ技术对官厅水库６个采样点固氮基因多样性分析的结果显示．随着富营养程度的增加．固氮微３．１水环境状况与固氮速率
生物的种类逐渐增多，水体固氮速率也增大。ｓ４．固氮速率受很多因素的影响：一般在低溶氧、低
ｓ５．ｓ６号采样点之问的同氮微生物种类还存在一定
万方数据
１１８４
吉林大学学报（地球科学版）
第４１卷
的差异。聚类分析结果显示，ｓ４和Ｓ６号采样点的大学，２００６：２８—３１．
相似度更高，而Ｓ５号采样点的群落结构则与ｓ４，Ｓ６ＹＵＹｏｎｇ－ｙｏｎｇ．Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｗａｔｅｒｅｕｔｒｏｐｈｉｃａｔｉｏｎｉｎ号差异很大；由此可以推断富营养程度最高的Ｓ５号Ｇｕａｎｔｉｎｇ
ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ［Ｄ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｂｅｉｊｉｎｇ
ＮｏｒｍａｌＵｎｉ—
采样点应该具有某些固氮能力更强的固氮微生物，ｖｅｒｓｉｔｙ，２００６
ｚ
２８—３１．
可以进行更深一步的研究。
［５］ＷａｎｇＸＴ，ＣｈｕＳＧ，ＸｕＸＢ．Ｏｒｇａｎｏｃｈｌｏｒｉｎｅｐｅｓｔｉ－
ｃｉｄｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎ
ｗａｔｅｒ
ｆｒｏｍＧｕａｎｔｉｎｇ
ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ
ａｎｄ
４
结论
Ｙｏｎｇｄｉｎｇ
Ｒｉｖｅｒ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｂｕｌｌ
ＥｎｖｉｒｏｎＣｏｎｔａｍ
Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００３，７０（２）：３５ｉ一３５８．
１）官厅水库各采样点水质及富营养化程度差异
［６］Ｚｈａｎｇ
ｚ，ＨｕａｎｇＪ，ＹｕＧ，ｅｔａ１．ＯｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆＰＡＨｓ，性大，妫水河流域相对较好，而库区则出现富营养化ＰＣＢｓ
ａｎｄ
ｏｒｇａｎｏｃｈｌｏｒｉｎｅ
ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓｉｎ
ｔｈｅ
Ｔｏｎｇｈｕｉ
现象，发生严重的铜绿微囊藻水华。
Ｒｉｖｅｒｏｆ
Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ
Ｐｏｌｌｕｔ，２００４，１３０
２）官厅水库６个采样点均能检测到生物固氮现（２）：２４９—２６１．
・
象，固氮速率为０．１７２～９．３５ｎｍｏｌ／（ｍ３・ｄ），富营［７］ＭａｎｇａｌｉｓｏＪＧ，ＳｔｅｐｈａｎｉｅＪＧ．Ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎ
养化程度最严重的Ｓ５采样点固氮速率最大，富营养ｆｉｘａｔｉｏｎｉｎＬａｋｅ
Ｍａｌａｗｉ／Ｎｙａｓａ［Ｊ］．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，
化程度轻的Ｓ３采样点固氮速率最小。固氮速率和２００８，５９６（１）：２５１—２６７．
氨氮、总氮、总磷浓度正相关相关系数分别为Ｐ＝
［８］Ｊｏｓｅｐｈ
Ｐ
Ｍ，ＣａｒｏｌｙｎＭＨ，ＺｅｈｒＪＰ．ｅｔａ１．Ｈｉｇｈ
ｒａｔｅｓ
ｏｆ０．９９８，ｒ＝Ｏ．０００；Ｐ＝０．９８６，，．＝０．０００；Ｐ一０．９６８，
Ｎ２
ｆｉｘａｔｉｏｎｂｙｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓ
ｉｎｔｈｅ
ｒ＝０．００２。
ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃ
Ｐａｃｉｆｉｃ
Ｏｃｅａｎ［Ｊ］．Ｌｅｔｔｅｒｓ
ｔｏ
Ｎａｔｕｒｅ，
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３）固氮ｎｉｆＨ基因的ＰＣＲ—ＤＧＧＥ分析结果显［９］ＧｒｕｂｅｒＮ，ＳａｒｍｉｅｎｔｏＪＬ．Ｇｌｏｂａｌｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｍａｒｉｎｅ示，６个采样点的固氮微生物种类差异性很大。固ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎａｎｄ
ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｌｏｂ
Ｂｉｏｇｅｏ—
氮速率最大的Ｓ５采样点固氮微生物条带最多，多样ｃｈｅｍＣｙｃｌｅｓ，１９９７，１１．．２３５—２６６：
性指数也显示Ｓ５处固氮微生物多样性最好。固氮［１０３ＬｉｐｓｃｈｕｌｔｚＦ，ＯｗｅｎｓＮＪＰ．Ａｎａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｎｉｔｒｏ－
微生物多样性和固氮速率呈正相关。
ｇｅｎ
ｆｉｘａｔｉｏｎ
ａｓａｓｏｕｒｃｅ
ｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｔｏ
ｔｈｅＮｏｒｔｈＡｔ—
４）官厅水库夏季水华发生时水体有明显的生物ｌａｎｔｉｃ
Ｏｃｅａｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｇｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。１９９６，３５（１）：２６１
固氮能力。且随着水体营养程度的增加，固氮微生物—２７４．
的种类随之增多，同时固氮速率也随之增大，这可能［１１］ＭｉｃｈａｅｌｓＡＦ，ＯｌｓｏｎＤ，ＳａｒｍｉｅｎｔｏＪＬ，ｅｔａ１．Ｉｎ－
会对本已富营养化的水体产生更大的危害。
ｐｕｔｓ．１０ｓｓｅｓ
ａｎｄ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ
ｏｆ
ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ａｎｄ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｉｎｔｈｅｐｅｌａｇｉｃＮｏｒｔｈＡｔｌａｎｔｉｃＯｃｅａｎ［Ｊ］．
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Ｄ，ＬｅｔｅｌｉｅｒＲ，ＴｕｐａｓＬ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｎｉ—ｔｈｅｉｒｔｏｘｉｎｓ
ｉｎＧｕａｎｔｉｎｇ
ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｏｆＢｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
ｔｒｏｇｅｎ
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ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａ１．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｎｕｔｒｉｅｎｔｏｆＧｕａｎｔｉｎｇ
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ｔｏｎ
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Ｎｏｒｔｈ
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［１５３
ＷｕｒｔｓｂａｕｇｈＷＡ，ＨｏｍｅＡＪ．ＩｒｏｎｉｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃＣｌｅａｒ
Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇｒｅｍｏｔｅｓｅｎｓｉｎｇ
ｔｏ
ａｎａｌｙｚｅｎｏｎ－ｐｏｉｎｔ
ｓｏｕｒｃｅ
Ｌａｋｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ：ｉｔｓｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ
ｆｏｒ
ａｌｇａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｐｏｌｌｕｔｉｏｎｐｒｏｂｌｅｍｓｉｎｒｉｐａｒｉａｎｂｕｆｆｅｒｓｔｒｉｐｓｏｆＧｎａｎｔｉｎｇ
ｆｉｘａｔｉｏｎａｎｄｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｉｓｈｅｒｉｅｓ
ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ［Ｊ］．Ａｃｔａ
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万方数据
第４期孙寓姣，等：官厅水库生物固氮作用对水体富营养化的响应
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ａｎｄ
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１１８５
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Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ
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ｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ
Ａｔｌａｎｔｉｃ
ｆｉｘａｔｉｏｎ
ｂｙ
Ｔｒｉ－
［１７］ＭｕｙｚｅｒＧ，ＤｅＷａａｌＥＣ，ＵｉｔｔｅｒｌｉｎｄｅｎＡＧ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ
ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ
ｏｆｃｏｍｐｌｅｘｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｂｙｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉ—
ｅｎｔ
ｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍｉｎｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｔｕｒｅ，２００１，４１１：６６—６９．
Ｏｃｅａｎ［Ｊ］．Ｎａ—
ｇｅｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
１６Ｓ
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万方数据
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ｓｉｓ
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ｍｉｎａｎｔ１６５ｒＲＮＡ－ｄｅｆｉｎｅｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｉｎａ
ｈｏｔｓｐｒｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌｍａｔ
ｅｘａｍｉｎｅｄ
ｂｙｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌ
ｅ—
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ
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Ｅｃｏｌ
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ｔｉｏｎｉｎｆｉｖｅｌａｋｅｓｄｉｆｆｅｒｉｎｇｉｎｔｒｏｐｈｉｃ
ｓｔａｔｕｓ
ａｎｄｈｕｍｉｃ
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ｔｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｏｐ
ｌａｎｋｔｏｎ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ａｎｄ
ｓｅａｓｏｎａｌｄｙｎａｍｉｃｓｉｎｔｗｏｎｅｉｇｈｂｏｕｒｉｎｇｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ
ｌａｋｅｓ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＭｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００１，３
（１１）：６８０—６９０．
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ＡＣ，ＫｅｎｔＡＤ．ＬａｕｓｔｅｒＧＬ，ｅｔａ１．Ｔｅｍ－
ｐｏｒａｌｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｔｈｒｅｅｔｅｍ－
ｐｅｒａｔｅ
ｌａｋｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｏｐｈｉｃｓｔａｔｕｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
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ｓｐｏｎｓｅ
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Ｌａｋｅ
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官厅水库生物固氮作用对水体富营养化的响应
作者：
作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
孙寓姣， 陈程， 丁爱中， 程莉蓉， SUN Yu-jiao， CHEN Cheng， DING Ai-zhong， CHENG Li-rong北京师范大学水科学研究院,北京,100875
吉林大学学报（地球科学版）
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