实验四 淀粉酶的初步分离纯化
实验四 淀粉酶的初步分离纯化
一、目的和要求
1. 掌握盐析法初步分离纯化蛋白质的原理和方法；
2. 掌握透析脱盐浓缩蛋白质的原理和方法。
3. 掌握膜分离原理和方法
二、基本原理
1. 蛋白质的盐析
蛋白质是亲水胶体，借水化膜和同性电荷（在PH 值7.0的溶液中一般蛋白质带负电荷）维持胶体的稳定性。由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当向蛋白质溶液中加入少量碱金属或碱土金属的中性盐类[如(NH4) 2SO 4、Na 2SO 4、NaCl 或MgSO 4等]时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上
的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大，因此蛋白质、酶等在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加，此时称为盐溶；当盐浓度不断上升并达到一定浓度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。
由盐析所得的蛋白质沉淀，经过透析或用水稀释以减低或除去盐后，能再溶解并恢复其分子原有结构及生物活性，因此由盐析生成的沉淀是可逆性沉淀。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。
2. 透析脱盐的原理
蛋白质的分子很大，其颗粒在胶体颗粒范围（直径1～100nm ）内，不能透过半透膜。选用孔径合宜的半透膜，使小分子物质能够透过，而蛋白质颗粒不能透过，这样就可使蛋白质和小分子物质分开。把蛋白质溶液装入透析袋中，袋的两端用线扎紧，然后用蒸馏水或缓冲液进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完毕。这种方法可除去和蛋白质混合的中性盐及其他小分子物质，是常用来纯化蛋白质的方法。透析需要较长时间，常在低温下进行，并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。
三、试验材料
1. 培养基
种子培养基：牛肉膏5g 蛋白胨10g NaCl 5g 可溶性淀粉 2g 葡萄糖1.5g /1000ml H2O 配100ml
发酵培养基：牛肉膏5g 蛋白胨10g NaCl 5g可溶性淀粉 2g /1000ml
2. 酶活测定溶液
0.2mol/LpH6.8 PBS缓冲液 葡萄糖标准液1mg/mL DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸试剂）
3. 试剂
蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、(NH4) 2SO 4、NaOH 、HCl 、、Na 2HPO 4•12H 2O 、NaH 2PO 4•H 2O 、EDTA
4. 仪器或其它用具
微量移液器、移液器枪头、透析袋、恒温培养箱、摇床、紫外检测仪（分光光度计）、离心机、分析天平、pH 计、量筒、250ml 瓶、分装架、记号笔、纱布、酒精灯、灭菌锅、干燥箱、恒温水浴锅等；
四、试验路线
发酵培养→粗酶液制备→硫酸铵盐析→透析脱盐浓缩→浓缩酶液酶活测定
五、操作步骤
1. 菌株发酵
将实验一中纯化的菌株接入种子培养基摇瓶培养24h ，2% 的接种量接种到发酵培养基，37℃，180r/min，培养36h ；
2. 粗酶液的制备
发酵液在8000r/min离心20min ，收集上清液即为粗酶液，测定酶活方法参见实验三DNS 测淀粉酶活力。
3. 硫酸铵盐析
3.1 盐析条件的确定
40%、60%和80%
盐析步骤
1）发酵液上清分装至3支烧杯中，每个20ml ；
2）加硫酸铵至3支烧杯中，对照25℃硫酸铵饱和度配置表，使其饱和度分别为40%、60%和80%。在加硫酸铵时需缓慢的加入，同时不断的轻柔搅拌（否则局部浓度过高会使酶失活）使硫酸铵完全溶解；
3）室温静置2h ，出现白色沉淀
4）离心，分别取沉淀用少量0.2mol/LpH6.8 PBS缓冲液回溶。
4. 透析脱盐浓缩
4.1 透析膜前处理
透析袋的预处理方法：
1）将透析袋剪成合适的长度；
2）在一只250 mL的玻璃烧杯中，加入200 mL的透析袋处理液，微波炉中预热；
3）将透析袋装入其中，电炉上煮沸10 min；
4）用蒸馏水彻底洗涤；
5）蒸馏水中煮10 min；
6）冷却后4℃存放，存放过程中透析袋应完全放入0.02mol/L磷酸酸缓冲液（pH7.0）中
7 用细线扎紧透析袋一端，注入清水检验不漏后加入不超过透析袋体积1/2的须透析溶液。
4.2 操作
1 沉淀用少量0.2mol/LpH6.8 PBS缓冲液回溶，移入透析袋中，经透析膜袋在20倍量0.02mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）中在室温，36h 透析脱盐（每过6h 换一次透析液).
2 取各梯度脱盐沉淀5ml 8000r/min离心20min ，取上清测酶活。（沉淀为变性蛋白质酶活很低。）
5. 酶活力的测定
参照实验三中的酶活测定。
实验数据
粗酶液 540nm 0.291 0.314
盐析 40% 60% 80%
1.221 2.708 1.456
七、实验报告
1. 实验结果
（1）测定粗酶液酶活；
粗酶液 540nm 0.291 0.314 （取平均值)
酶活力 9.705
（2）测定透析后酶液的酶活力
40% 60% 80%
540nm 吸光度 1.221 2.708 1.456
酶活力 36.63 81.24 43.68
实验结果分析
通过比较可知 在硫酸铵饱和度为 60%时分离纯化淀粉酶酶活力最高。经盐析，透析除盐后酶活力大大提高纯化后的酶活力约为粗酶活力的4~9倍。
六、注意事项
（1）硫酸铵饱和度计算及加入方式：在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大时，可直接加固体硫酸铵，其加入量见附表。注意看清是25℃硫酸铵饱和度表
（2）清洗透析袋内外时，操作过程中应使用镊子或戴手套；
（3）蛋白质溶液用透析法去盐时，正负离子透过半透膜的速度不同。以硫酸铵为例，NH 4＋的透出较快. 在透析过程中膜内SO 42-剩余而生成H 2SO 4，而使膜内蛋白
质溶液呈酸性，足以达到使蛋白质变性的酸度，因此在用盐析法纯化蛋白质做透析去盐时，开始应用0.1M 的NH 4OH 透析，或者用缓冲液配制蛋白溶液。