微生物染色液配制及染色法
微生物染色液配制及染色法
2.1 美蓝染色法2.1.1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝 0.3g95%乙醇 30mL0.01%氢氧化钾溶液 100mL将美蓝溶解于乙醇中,然后与氢氧化钾溶液混合。2.1.2 染色法将涂片在火焰上固定,待冷。滴加染液,
染1~3min,水洗,待干,镜检。2.1.3 结果菌体呈蓝色。
2.2 革兰氏染色法2.2.1 结晶紫染色液结晶紫 1g95%乙醇 20mL1%草酸铵水溶液 80mL将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。2.2.2 革兰氏碘液碘 1g碘化钾 2g蒸馏水 300mL将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。2.2.3 沙黄复染液 沙黄 0.25g95%乙醇 10mL蒸馏水 90mL将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。2.2.4 染色法2.2.4.1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。2.2.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。2.2.4.3 滴加95%乙醇脱色,约30s;或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色10s。2.2.4.4 水洗,滴加复染液,复染1min。水洗,待干,镜检。2.2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红
色。注:亦可用1:10稀释石炭酸复红染色液作复染液,复染时间仅需10s。
2.3 耐酸性染色法(萎-倪二氏法)2.3.1 石炭酸品红染色液碱性品红 0.3g95%乙醇 10mL5%酚水溶液 90mL将品红溶解于乙醇中,然后与酚溶液混合。2.3.2 3%盐酸-乙醇浓盐酸 3mL95%乙醇 97mL2.3.3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。2.3.4 染色法2.3.4.1 将涂片在火焰上加热固定,滴加石炭酸品红染色液,徐徐加热至有蒸气出现,但切 不可使沸腾。染液如因蒸发减少时,应随时添加。染5min,倾去染液,水洗。
2.3.4.2 滴加盐酸-乙醇脱色,直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定,一般为1~3min),水洗。
2.3.4.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液,复染30s~1min,水洗,待干,镜检。2.3.5 结果:耐酸性细菌呈红色,
其他细菌、细胞等物质呈蓝色。
2.4 柯氏染色法2.4.1 染色液2.4.1.1 0.5%沙黄液。2.4.1.2 0.5%孔雀绿液。2.4.2 染色法2.4.2.1 将涂片在火焰上固定,滴加0.5%沙黄液,并加热至出现气泡,约2~3min,水洗。2.4.2.2 滴加0.5%孔雀绿
液,复染40~50s。水洗,待干,镜检。2.4.3 结果布氏杆菌呈红色,其他细菌及细胞呈绿色。
2.5 奥尔特氏荚膜染色法2.5.1 染色液沙黄 3g蒸馏水 100mL用乳钵研磨溶解。2.5.2 染色法将涂片在火焰上固定,滴加染色液,并加热至产生蒸气后,继续染3min。水洗,待干,镜检。2.5.3 结果炭疽
芽胞杆菌菌体呈赤褐色,荚膜呈黄色。
2.6 瑞氏染色法2.6.1 染色液瑞氏色素 0.1g甲醇 60mL用乳钵研磨溶解。2.6.2 染色法2.6.2.1 涂片待自然干燥后,滴加染色液,固定1min。2.6.2.2 加入等量蒸馏水(pH6.5),染色3~5min。2.6.2.3 用
蒸馏水冲洗,待干,镜检。
2.7 鞭毛染色法2.7.1 染色液的配制2.7.1.1 甲液:称丹宁酸5g、氯化高铁(FeCl3)1.5g,溶于100mL蒸馏水中,待溶解后加入1%的氢氧化钠溶液1mL和15%的甲醛溶液2mL。2.7.1.2 乙液:称2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化铵溶液,到出现沉淀后,再滴加使其变为澄清,然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中,至出现轻微雾状为止(此为关键性操作,应特别小心)。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时,要边滴边充分摇荡,染液当天配,当天使用,2~3d基本无效。2.7.2 染色法在风干的载玻片上滴加甲液,4~6min后,用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液,缓缓加热至冒汽,维持约半分钟(加热时注意勿使出现干燥面)。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色,停止加热,用水冲净,干后镜检,菌体及鞭毛为深褐色到黑色。2.8 碱性复红染色法将0.5g碱性复红染料溶解于20mL95%乙醇中,然后用蒸馏水稀释至100mL。如有不溶物时,可用滤纸过滤,或静置后取上清液备用。注:本染色液系用于苏云金芽胞
内蛋白质毒素结晶的染色,藉以与蜡样芽胞杆菌相区别
实验用染色液及试剂的配制
1.黑色素液 水溶性黑素10g,蒸馏水100mL, 甲醛(福尔马林)0.5mL。可用作荚膜的背景染色。
2.墨汁染色液 国产绘图墨汁40mL,甘油2mL,液体石炭酸2mL。先将墨汁用多层纱布过滤,加
甘油混匀后,水浴加热,再加石炭酸搅匀,冷却后备用。用作荚膜的背景染色。
3.吕氏(Loeffier)美蓝染色液
A 液:美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3g, 95%乙醇30mL;
B 液:0.0l% KOH l00mL。
混合A 液和B 液即成,用于细菌单染色,可长期保存。根据需要可配制成稀释美蓝液,按1:10 或
1:100 稀释均可。
4.革兰氏染色液
(1)结晶紫(crystal violet)液:结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g 溶于20mL95%乙醇中)20mL,1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h 后过滤即成。此液不易保存,如有沉淀出现,需重新配制。
(2)卢戈(Lugol)氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加蒸馏水至300mL 即成。配成后贮于棕色瓶内备用,如变为浅黄色即不能使用。
(3)95%乙醇:用于脱色,脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。
(4)稀释石炭酸复红溶液:碱性复红乙醇饱和液(碱性复红1g, 95%乙醇l0mL, 5%石炭酸90mL 混合
溶解即成碱性复红乙醇饱和液),取石炭酸复红饱和液l0mL 加蒸馏水90mL 即成。
(5)番红溶液:番红O(safranine,又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL,溶解后可贮存于密闭的棕色瓶
中,用时取20mL 与80mL 蒸馏水混匀即可。
以上染液配合使用,可区分出革兰氏染色阳性(G+)或阴性(G-)细菌,G-被染成蓝紫色,G+被染成淡
红色
5. 鞭毛染色液
A液:丹宁酸5.0g, FeCl3 1.5g,15%甲醛(福尔马林)2.0mL,l%NaOH 1.0mL,蒸馏水l00mL;
B 液:AgNO3 2.0g, 蒸馏水100mL。
待AgNO3 溶解后,取出l0mL 备用,向其余的90mLAgNO3 中滴加NH4OH,即可形成很厚的沉淀,继续滴加NH4OH 至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止,再将备用的AgNO3 慢慢滴入,则溶液出现薄雾,但轻轻摇动后,薄雾状的沉淀又消失,继续滴入AgNO3,直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止,如雾重,说明银盐沉淀出,不宜再用。通常在配制当天便用,次日效果欠佳,第3 天则不能使用。
6. 0.5%沙黄(Safranine)液:2.5%沙黄乙醇液20mL,蒸馏水80mL。将2.5%沙黄乙醇液作为母液保
存于不透气的棕色瓶中,使用时再稀释。
7. 5%孔雀绿水溶液:孔雀绿5.0g,蒸馏水100mL。
8. 0.05%碱性复红:碱性复红0.05g,95%乙醇100mL。
9.齐氏(Ziehl)石炭酸复红液:碱性复红0.3g 溶于95%乙醇l0mL 中为A 液:0.01%KOH溶液l00mL
为B 液。混合A、B 液即成。
10.姬姆萨(Giemsa)染液
(1)贮存液:称取姬姆萨粉0.5g,甘油33mL,甲醇33mL。先将姬姆萨粉研细,再逐滴加入甘油,继
续研磨,最后加入甲醇,在56℃放置1~24h 后即可使用。
(2)应用液(临用时配制):取1mL 贮存液加19mL pH7.4 磷酸缓冲液即成。亦可取贮存液:
甲醇=1:4 的比例配制成染色液。
11.乳酸石炭酸棉蓝染色液(用于真菌固定和染色) 石炭酸(结晶酚)20g,乳酸20mL,甘油40mL,棉蓝0.05g,蒸馏水20mL。将棉蓝溶于蒸馏水中,再加入其他成分,微加热使其溶解,冷却后用。滴少量染液于真菌涂片上,加上盖玻片即可观察。霉菌菌丝和孢子均可染成蓝色。染色后的标本可用树脂封固,
能长期保存。
12. 1%瑞氏(Wright’s)染色液:称取瑞氏染色粉6g,放研钵内磨细,不断滴加甲醇(共600mL)并继续研磨使溶解。经过滤后染液须贮存一年以上才可使用,保存时间愈入,则染色色泽愈佳。
13.阿氏(Albert) 异染粒染色液:
A 液:甲苯胺蓝(toluidine blue)0.15g,孔雀绿0.2g,冰醋酸lmL,95%乙醇2mL,蒸馏水100mL;
B 液:碘2g, 碘化钾3g,蒸馏水300ml。
先用A 液染色1min,倾去A 液后,用B 液冲去A 液,并染1min。异染粒呈黑色,其他部分为暗
绿或浅绿