ERK5调节成骨细胞功能的研究_程群
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・论著・
ERK5调节成骨细胞功能的研究
程群 朱汉民 甘洁民 缪应新 施泓
中图分类号:R336 文献标识码:A 文章编号:100627108(2008)1220845204
摘要:目的 研究ERK5在成骨细胞的表达及IL26对其表达的调控,初步探讨ERK5在成骨细胞增殖分化中的作用。方法 应用免疫印迹法检测人、大鼠、小鼠成骨细胞和MG263细胞ERK5的表达;用
IL26作用于MG263细胞,检测不同时间和剂量干预后ERK5和P2ERK5表达情况,构建ERK5siRNA和
空白对照质粒,转染MG263细胞,IL26干预细胞后检测各组细胞增殖率、碱性磷酸酶活性和骨钙素表达的差异。结果 在人、大鼠、小鼠成骨细胞和MG263细胞中均有ERK5的表达;IL26可呈时间、剂量依赖性的提高ERK5的磷酸化;与对照组相比,ERK5siRNA的成骨细胞IL26刺激后增殖降低,骨钙素表达量下降且差异有统计学意义,而碱性磷酸酶活性的变化差异无显著性。 信号通路的活性受IL26调控,ERK5。关键词:成骨细胞;ERK5;IL26;RNA干扰;增殖;分化
StudyofERK5regulating,,GANJiemin,etal.ShanghaiGeriatricInstitute,,Shanghai200040,China
Abstract:Objective ofERK5onhuman,rat,mouseosteoblastsandtheregulationofIL26onERK5expression,preliminarilyinvestigatetheeffectofERK5onproliferationanddifferentiationofosteoblast.Methods TheproteinexpressionofERK5onosteoblastswasconfirmedbywesternblot.ERK5andP2ERK5weredetectedwhendifferentdoseofIL26treatedosteoblastduringdifferenttime.ERK5siRNAplasmidswereconstructedandtransfectedintoMG263cells.MTT,ALPactivityandosteocalcinexpressionweredetectedaftertreatedwith10nmolΠLIL26.Results ERK5wasexpressedinhuman,rat,mouseosteoblasts.ThephosphorylationlevelofERK5wereincreasedbyIL26ontimeanddosedependentmanner.Ascomparedtocontrolcells,ERK5siRNAcellsπMTTreduced,osteocalcinexpressionreduced(P
Keywords:Osteoblast;ERK5;IL26;RNAinterference;Proliferation;Differentiation
骨质疏松不仅表现为破骨细胞活性增强,而且合并有成骨细胞功能降低,尤其在病理状态下,某些体液因子和药物对成骨细胞功能的抑制已成为这些继发性骨质疏松症的主要发病机制。
丝裂原激活蛋白激酶(mitogen2activatedproteinkinase,MAPK)是将细胞外信号分子传入细胞内并使细胞作出相应反应的细胞内重要信号调节网络,ERK5是MAPK家族中组成成员之一,自从1995年被克隆后,成为MAPK最新的研究通路之一,在调节细胞增殖分化中起重要作用,并执行了一系列原以
基金项目:上海市科委计划项目(04ZR14044)
作者单位:200040 上海,复旦大学附属华东医院老年医学研究所
通讯作者:朱汉民,Email:[email protected]
为是由ERK1Π2来完成的功能。ERK5受到细胞外
理化因子和应激的广泛调控,已知IL26是有效的成骨细胞增殖促进剂,其通过调节成骨细胞和破骨细
[1]
胞功能对骨代谢产生影响,而且在体外实验中证实可以激活ERK1Π2,但IL26对ERK5信号通路的激活作用以及ERK5在成骨细胞功能和活性中的地位还不清楚,本次研究的目的是探讨ERK5在成骨细胞的表达和调控,并初步探讨该信号通路对成骨细胞增殖分化成熟的作用。
1 材料和方法
111 实验动物及主要试剂
成年雄性SD大鼠和昆明小鼠购于中科院上海分院动物房,人成骨肉瘤MG263细胞购于中科院上
846海细胞库。细胞培养基DMED和胎牛血清(GIBICO
BRL,USA),重组人IL26(peprotech,USA),ERK5、P2
βERK5、osteocalcin抗体、2actin抗体和辣根过氧化物
酶小鼠二抗(SantaCruz,USA),MTT、DMSO、TritonX2100(SigmaBRL,USA),碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物研究所),转染试剂:Lipfectamine2000(Invitrogen,USA)。
112 不同来源成骨细胞培养
预冷PBS洗2次,加入细胞裂解液,超声波破碎细胞
数次,Bradford法检测蛋白含量。60μg细胞总蛋白加4×上样缓冲液煮沸变性10min,10%的SDS聚丙烯酰胺电泳后转膜,015%脱脂奶粉封闭,与1∶1000的单克隆抗体4℃杂交过夜,杂交膜用TBST缓冲液洗3次,再与辣根过氧化物酶标记的二抗室温杂交1h后显影。电泳条带用BandScanV软件分析灰度值,结果以目的基因灰度值与β2actin灰度值的比值表示,取4次相同实验的结果进行统计学分析。115 细胞增殖率的检测
MG263细胞以每孔2×10密度接种于96孔板,
4
手术取正常成人松质骨、新生大鼠或小鼠头颅
3
骨,剪成1mm大小碎片,经磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗、振荡3次,加入Ⅳ型胶原酶于37℃水浴手动振摇消化15min,离心弃上清,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基接种至培养瓶,隔日换液。人MG263细胞接种于含10%胎牛血清、10mmolΠLHEPES、2mmolΠL谷胺酰胺、100IUΠmL青霉素和100μgΠmL链霉素的DMEM培养液中,每3日换液1次,5~7天传代。以上细胞生长至60%~80%予不同浓度的IL26干预。113 siRNAGeneBankERK5基因序列,根据http:ΠΠwww.ambion.comΠechlibΠmiscΠsiRNA-finder.html设计3对针对ERK5的siRNA,同时设计1条阴
每孔200μL,每组分别重复4孔,并设4个不含细胞
的完全培养基做空白对照,用含10%胎牛血清的DMEM培养24h后,,干预组加nmolI,,于48h收集,4h,用P10μL015%MTT,培养箱孵育4h,
LDMSO室温下静置10min后振荡5min,酶100μ
标仪490nm波长下测定各孔的吸光度(A)值,取4组平均值。
116 碱性磷酸酶(ALP)活性检测
MG263细胞以每孔2×10密度接种于96孔板,
4
性对照序列:siRNA1:CACGACAACATCATCGCCA;
siRNA2:CTATGTACACCAGCTACAG;siRNA3:GAA2AGATGGTGCCATCTCA;negative:TTCTCCGAACGT2GTCACGT。siRNA及阴性对照质粒由上海吉玛基因化学技术有限公司构建。转染前1天将MG263细胞
6
按每孔1×10接种于6孔培养板中,细胞汇合至
TM
70%~80%时用Lipofectin2000将siRNA转染入细胞,siRNA的转染浓度为200nmolΠL,转染方法按照
TM
Lipofectin2000说明书操作,每组设3个复孔,实验重复3次,转染后48h提取细胞总RNA,用实时定量PCR方法筛选1个最有效的siRNA(干扰效率≥75%,具体数据未提供),命名为pRNATU6122ERK5i,阴性对照质粒命名为pRNATU6122GFP。
将MG263细胞分为4组:①pRNATU6122GFP质粒转染细胞未加入IL26干预;②pRNATU6122GFP质粒转染细胞加入IL26干预;③pRNATU6122ERK5i质粒转染细胞未加入IL26干预;④pRNATU6122ERK5i质粒转染细胞加入IL26干预。转染24h后用10nmolΠL的IL26干预细胞,24~48h后用于细胞增殖率、碱性磷酸酶活性和蛋白表达的检测。114 Western印迹检测
培养于6孔板中的MG263细胞弃去培养液,用
每孔200μL,每组分别重复4孔,并设4个不含细胞
的完全培养基做空白对照,含10%胎牛血清的DMEM培养液培养24h后,换为无血清培养基,干预组加入浓度为10nmolΠL的IL26培养24h后,吸除孔内培养液,PBS洗涤2次,每孔加入1mL011%Triton2100作用30min后,加入基质液及缓冲液各50μL,充分混匀后37℃孵育15min,酶标仪520nm波长下测定各孔的吸光度值(A)值,取4组平均值。117 统计学处理
数据以均数±标准差表示,采用SPSS1010统计软件进行数据处理,组间差异统计学意义比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P
2 结果
211 ERK5在不同来源成骨细胞中的表达
westernblot结果显示116kd处可见一条带,大鼠
和人的成骨细胞表达量较小鼠高。ERK5磷酸化抗体检测结果显示,在基础状态下,成骨细胞中ERK5磷酸化的水平较低,见图1。
212 IL26时间依赖性的激活ERK5
IL26是成骨细胞成熟和分化的调节因子之一,
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01278±01024,在正常对照MG263细胞,IL26干预后
增值率明显升高(P
高,且与正常IL26干预相比差异有显著性(P
如表2所示,4组细胞的碱性磷酸酶活性分别为31116±011334、51367±01217、31149±01068、51038±01221,在正常对照组和ERK5iRNA组的MG263细胞,IL26干预后碱性磷酸酶活性均明显升
高(P
图1 ERK5在不同来源成骨细胞中的表达
统计学意义。
表2 不同处理组碱性磷酸酶活性比较(