酵母细胞破壁技术研究与应用进展
工艺技术
酵母细胞破壁技术研究
与应用进展
杨翠竹，李艳，阮南，牟德华，康明丽
（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄０５００１８）
摘要：随着啤酒行业的发展，啤酒生产中带来的废酵母数量与日俱增，造成了环境污染，废酵母的再利用成为人们关
注的焦点。酵母细胞内具有丰富的营养物质，充分利用这些营养物质需要对酵母细胞进行破壁，因而破壁技术就显得尤为重要。系统论述了当前破碎酵母细胞壁的方法和原理，以及各种方法的优缺点和应用现状，对酵母破壁技术的应用前景进行展望。
关键词：酵母细胞壁；破壁方法；应用中图分类号：ＴＳ２０１
文献标识码：Ｂ
文章编号：１００５－９９８９（２００６）０７－０１３８－０５
Ｓｔｕｄｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｂｏｕｔ
ｂｒｅａｋｉｎｇｙｅａｓｔｃｅｌｌｗａｌｌ
ＹＡＮＧＣｕｉ－ｚｈｕ，ＬＩＹａｎ，ＲＵＡＮＮａｎ，ＭＯＵＤｅ－ｈｕａ，ＫＡＮＧＭｉｎｇ－ｌｉ
（ＨｅｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００１８）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｒｅｗｉｎｇｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｂｅｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｉｌｌｂｒｉｎｇｍｏｒｅｗａｓｔｅｙｅａｓｔ，ｗｈｉｃｈｃａｕｓｉｎｇｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｕｓｅｏｆｒｅｊｅｃｔｉｎｇｙｅａｓｔｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｆｏｃｕｓｏｆｐｅｏｐｌｅ′ｓａｔｔｅｎｔｉｏｎ．Ｙｅａｓｔｃｅｌｌｓｈａｖｅｒｉｃｈｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．Ｔａｋｉｎｇａｌｌｔｈｅｓｅｎｕｔｒｉｅｎｔｓｒｅｑｕｉｒｅｔｏｂｒｅａｋｔｈｅｙｅａｓｔｃｅｌｌｓ，ｓｏｔｈｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｂｒｏｋｅｎｃｅｌｌｗａｌｌｉｓｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔ，ｓｏｄｉｓｃｕｓｓｅｓｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｙｅａｓｔｃｅｌｌｗａｌｌｂｒｏｋｅｎ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓ．ｆｏｒｅｇｒｏｕｎｄｏｆｔｈｅｂｒｅａｋｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＹｅａｓｔｃｅｌｌｗａｌｌｉｓｐｒｏｓｐｅｃｔｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｙｅａｓｔｃｅｌｌｗａｌｌ；ｂｒｅａｋｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｃｅｌｌｗａｌｌ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
我国啤酒工业发展迅速，２００５年我国啤酒产量达到３０６１．５６万ｔ，已连续４年位居全世界首位。其中河北省啤酒产量１４２．９６万ｔ。该行业的迅速发展带来废弃酵母量的增加，在啤酒生产中，每生产１００ｔ啤酒可得到含水分７５％～８０％的废弃酵母１．５ｔ，可制成含水８．５％～９％的干酵母约０．３５ｔ。依此数据计算，２００５年全国可由废弃酵母回收制得干酵母１０．７２万ｔ，河北省可产５００ｔ啤酒干酵母。
收稿日期：２００６－０４－２７
基金项目：石家庄市科技局重大科技攻关课题（０５１１７１３２Ａ）。
啤酒生产中的废弃酵母除少部分回收外，大部分在贮酒过程中，与其他杂质一起沉淀到贮酒罐底，如果这些酵母被直接排放到下水道，造成啤酒生产废水中极高的ＣＯＤ（化学需氧量）负荷。据计算每生产１万ｔ啤酒其废水的ＣＯＤ负荷为７１５０ｋｇ。由此可见啤酒行业产生的废酵母如不加以回收利用，会给我国的环境产成很大的压力，不利于我国经济的发展和人们的身体健康。目前许多啤酒生产
作者简介：杨翠竹（１９７７－），女（汉族），硕士研究生，研究方向为传统发酵创新技术研究。
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７．
工艺技术
工厂已经意识到了这一点，因此他们把废酵母进行干燥，作为饲料卖给周围的饲养户。这样处理费酵母就存在酵母的附加值比较低的问题，如何更好的利用酵母资源是目前广大研究学者研究的一个热点问题。
啤酒废酵母全身都是宝。它含有５０％的蛋白质，４％～８％的核糖核酸（ＲＮＡ），２％的Ｂ族维生素，１％的谷胱甘肽及辅酶Ａ，此外还有丰富的氨基酸。如果能将我国每年啤酒行业产生的废弃酵母全部利用，则可以回收大量高附加值的资源，同时可以避免污染环境。啤酒酵母的干物质组成含量见表１，啤酒酵母蛋白质中氨基酸的组成见表２。
表１啤酒酵母干物质含量
成分蛋白质脂肪核糖核酸Ｂ族维生素谷胱甘肽及辅酶Ａ
含量（％）５０３４～８０．７１
２００６年全国可产２００６年河北省
生（１００ｔ）可产生（１００ｔ）
５３６３２４３～８６７．５１０．７２
２５１．５２～４０．３５０．５
甘露聚
糖蛋白
２酵母细胞壁的结构
微生物细胞壁的结构和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互交连的程度，破碎细胞的主要阻力来自于连接细胞壁网状结构的共价键。了解细胞壁的组成和结构，有助于选择合适的破壁方法。
酵母菌属于单细胞真核微生物，其细胞壁的厚度大约为０．１～０．３μｍ，当细胞老化时，厚度还会增加。酵母细胞壁的主要构成为葡聚糖（３５％～４５％）、甘露聚糖（４０％～４５％）、蛋白质（５％～１０％）、几丁质（１％～２％）、脂类（３％～８％）、无机盐（１％～３％）。
酵母细胞壁结构坚韧，像三明治———外层为甘露聚糖（Ｍａｎｎａｎ），内层为葡聚糖（Ｇｌｕｃａｎ），他们都是复杂的分枝状聚合物，中间夹有１层蛋白质分子。酵母细胞壁结构见图１。
磷酸化的甘露聚糖
甘露聚糖
表２啤酒酵母蛋白质中氨基酸的组成
氨基酸谷氨酸赖氨酸亮氨酸缬氨酸酪氨酸苏氨酸丝氨酸精氨酸
含量（ｇ／１００ｇ）０．７７６０．４５１０．４４６０．３４５０．３３４０．３１８０．２８６０．２６１
氨基酸甘氨酸丙氨酸组氨酸色氨酸天门冬氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸半胱氨酸异亮氨酸
含量（ｇ／１００ｇ）
０．２３０．１８１０．１１９０．０３６０．３３８０．２４５０．１１５０．０６０．０３３６
酵母破壁方法
葡聚糖细胞质膜
图１啤酒酵母菌细胞壁结构示意图
３酵母细胞破壁方法
酵母细胞壁较厚，很难破除，必须利用外力使之破坏或分解。目前报道的关于酵母破壁的方法很多，按照作用于酵母细胞壁的部位不同进行分类，见图２。
破坏细胞葡聚糖结构的方法破坏细胞蛋白质结构的方法
破坏细胞甘露聚糖结构的方法
外加蛋白酶法
外加甘露聚糖酶法
破坏细胞多处结构的方法
碱法破壁
外加葡聚糖酶法表面活性剂处理
酸碱处理
盐破壁法
高冻微超研挤复有压溶波生磨压合机均法加波法式酶溶浆热破破法剂破法壁壁壁法法
图２酵母细胞破壁方法
４酵母细胞破壁原理及应用４．１破坏酵母细胞壁葡聚糖层４．１．１
碱破壁法
构成酵母细胞壁的葡聚糖有两层：
一层是可以被碱水解的，另一层则不溶于碱。当利用碱溶液对酵母进行破壁时，碱可以溶解掉酵母细胞壁中的碱可溶性葡聚糖层，同时溶解部分脂类，从而使酵母细胞壁的通透性变大，胞内物质容易析出。本研
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工艺技术
究室在从废弃啤酒酵母泥中提取核酸时曾利用氢氧化钠溶液对啤酒酵母进行破壁，结果见表３。
表３啤酒酵母的氢氧化钠溶液破壁试验
试验号１２３４５６７８９
酵母菌体浓氢氧化钠浓破壁时间破壁温度破壁率度（％）度（％）（ｈ）（℃）（％）
８８８１０１０１０１２１２１２
３．０３．５３．８３．０３．５３．８３．０３．５３．８
２．０２．５３．０２．５３．０２．０３．０２．０２．５
８０９０１００１００８０９０９０１００８０
４５．６７７２．７３８７．１０６８．６３７８．７２８５．２５６５．６７９５．７４４１．６７
白酶对酵母破壁。
４．３破坏甘露聚糖层的方法
甘露糖酶可以专一的水解细胞壁上的甘露糖，使得细胞壁的结构破坏。很多酵母破壁复合酶中就含有甘露聚糖酶。
４．４破坏多处细胞结构的方法４．４．１
盐法破壁
高浓度的盐可以产生高的渗透压，
破坏酵母细胞壁的通透性，使得细胞失水，质壁分离，在外力的作用下细胞自身破裂而释放出内溶物，见图３所示。本研究室用氯化钠对啤酒酵母细胞进行破壁实验研究，结果见表４。
张淑桂等［１］在提取酵母ＲＮＡ时用稀碱法进行了破壁试验，最佳工艺条件为碱浓度１．０％、菌浓度１０％。毛宁等［２］在提取酵母ＲＮＡ时，曾经用氨法进行破壁，提取率达到２％。
４．１．２外加葡聚糖酶进行破壁鉴于酵母的细胞壁中有大量的葡聚糖成分，葡聚糖对支持酵母细胞壁的结构有着举足轻重的作用。因此，人们在破碎细胞壁时常加入葡聚糖酶来破坏细胞壁。但是仅加入葡聚糖酶破壁效果并不是很好，因此加酶常常结合其它破壁方法使用。
４．２破坏细胞壁的蛋白质层４．２．１表面活性剂处理法
酵母细胞壁含有５％～１０％
的蛋白质，加入表面活性剂可以作用于与膜结合的蛋白质，形成胶束而溶解膜，使得细胞破碎。但是需要合适的表面活性剂浓度，而且要在适宜的ｐＨ值、离子强度和温度下才能有效的破碎细胞。
十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）是较有效的菌体破壁剂，有结果表明用ＳＤＳ处理细胞，细胞内蛋白质释放率最高达到８％［３］。４．２．２
酸碱处理法
蛋白质为两性电解质，改变ｐＨ
值可以改变其电荷性质，使蛋白质之间或蛋白质与其它物质之间的相互作用力降低而易于溶解。因此利用酸碱调节ｐＨ值可以加快细胞壁的溶解。４．２．３外加蛋白酶破壁法利用酶的水解作用，在进行细胞破壁时也可以添加蛋白酶来水解细胞壁的蛋白质层，加快细胞壁的破解。本研究室通过试验证明只添加蛋白酶破壁效果不是很理想，实际应用中蛋白酶常常和其它破壁方法混合使用。一般来讲酶法破碎酵母细胞时，需要先加入蛋白酶作用蛋白质－甘露聚糖结构，再加入葡聚糖酶作用于葡聚糖层。最后改变渗透压使细胞膜破裂，胞内物质溶出。晏志云［４］为了提高从酵母中提取氨基氮的量使用外加蛋
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７．图３盐法渗透表４氯化钠破壁试验
试验号１２３４５６７８９
酵母菌体浓氯化钠浓破壁时间破壁温度破壁率
度（％）度（％）（ｈ）（℃）（％）
１０１０１０１５１５１５１７１７１７
１．５２．０２．５１．５２．０２．５１．５２．０２．５
１．５２．０２．５２．０２．５１．５２．５１．５２．０
５０６０７０７０５０６０６０７０５０
２０．００５０．００５４．５５９．８０４６．３０２６．８３６９．７７３８．４６２４．３９
王凤琴［５］在从啤酒废酵母中提取ＲＮＡ时就曾使用１０％的食盐对酵母进行破壁。
４．４．２高压匀浆法、超声波法、微波加热法、挤压式破壁高压匀浆法（Ｈｉｇｈ－ｐｒｅｓｓｕｒｅｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）所用设备是利用高压匀浆机，其原理是由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂，在撞击力和剪切力等的综合作用下破坏细胞。
超声波指频率超过人耳能听得见的频率范围的声波，其频率一般在２０ｋＨｚ以上，是一种弹性机械震动波。当超声波在液体介质中引起空化作用，产生大量直径１０μ的空泡，空泡随后爆裂。在此过程中，产生高达几千大气压的冲击波和局部高温，而使细胞破碎。
微波是频率介于３００ＭＨｚ和３００ＧＨｚ之间的电磁波，微波加热法（Ｍｉｃｒｏｗａｖｅｈｅａｔｉｎｇ）是利用微波场将电能转化为热能。导致细胞内的极性物质尤其是水分子
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吸收微波能，产生大量的热能，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，进一步加热，导致细胞内部和细胞壁的水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞或裂纹的存在使得胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物。
挤压式破壁法是利用外力对酵母细胞壁产生挤压作用，使之破碎。
上述４种方法都是利用压力使酵母细胞壁破裂，
图４压缩、撞击破碎
见图４，具体产生压力的方式不同，见表５。
表５高压匀浆法、超声波法、微波加热法、挤压式破壁法原理及优缺点
破壁方法高压均浆法
破壁原理
由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂；同时消除了底物和酶的空间位阻，加速酵母细胞的自溶；有利于大分子的降解和小分子溶出
气泡产生的高压力和局部高温
微波将电能转化为热能，细胞中的水被加热，由
液态变为气态，液态水汽化产生压力
利用其它方式产生高压
优点处理量大速度快
缺点需要重复破碎
超声波法微波加热法挤压式破壁
省时、高效、操作简单、噪音大、散热困难、敏感活性
液量损失少物质失活、实验室规模应用穿透力强、选择性高、加热效率高制备极不稳定的产物
适用于对热稳定的产物、对原
料要求高不能放大，实验室应用
晏志云等［４］报道，高压均质作为一种破壁处理方法可显著加速酵母的自溶。孙海翔等［６］报道在提取酵母细胞中核酸时，用７０ＭＰａ、１５％浓度的酵母悬浮液，均质２～３次，破壁效果较好。黄淑霞等［７］曾经报道采用高压均质法与其他破壁方法结合提取酵母中核酸，采用４０ＭＰａ均质２～４次效果较好。
潘飞［８］等在从啤酒酵母中提取还原型谷光甘肽时曾用到超声波的方法。曾俊华等［９］在《破碎酵母释放腺苷蛋氨酸》一文中，也用超声波法对酵母进行破壁。发现在破碎频率２４Ｈｚ，时间１３ｍｉｎ，破壁效果最佳，可达７５％。他同时用高压氮气对酵母进行３次的循环挤压破壁，使得蛋氨酸的提取收率高达８５％［１０］。
刘传斌等［１１］在从酵母细胞内提取海藻糖时，用微波加热法破壁，经实验发现，酵母细胞在微波加热１ｍｉｎ后，细胞壁破裂，该方法提取海藻糖比采用传统工艺收率提高２０％。
４．４．３研磨法利用研钵、石磨、球磨、珠磨机等研磨器械所产生的剪切力将细胞破碎。使用时常将细胞悬浮液与研磨剂一起研磨，利用研磨剂与研磨剂和酵母细胞之间的互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内容物。
研磨法虽然有利于破壁，在合适条件下一次操作就可以达到较高的破碎率。但是，料液损失严重。
曾俊华［９］在从酵母中提取腺苷蛋氨酸时，曾用液氮研磨酵母细胞壁来达到破壁的效果。姚洪文［１２］对酵母细胞破碎技术进行了实验比较后，认为纳米级微
生物细胞破碎机是理想的细胞破碎工具。
４．４．４冻融法将细胞冻结后再融化。冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性。同时由于细胞内水的结晶使细胞内外产生溶液浓度差，产生渗透压，并且细胞内形成的冰晶也会破坏细胞壁。
蔡俊［１３］采用变温法对酵母进行破壁，温差９０℃，高温保持２０ｍｉｎ，ｐＨ值６．５、冷却２０ｍｉｎ，此时酵母细胞平均破壁率为７４．７２％。
４．４．５有机溶剂法许多有机溶剂如苯、甲苯等处理细胞，可以增加细胞的通透性使细胞内物质易于释放。韩刚［１４］研究发现，氮酮对生物膜类脂具有特异性溶解作用，使酵母菌细胞内膜类脂流动性增强，可促进酵母菌体内蛋白质释放。明景熙［１５］认为在从啤酒酵母中提取ＳＯＤ（超氧化物歧化酶）时，用异丙醇破壁效果最好。４．４．６
复合酶破壁法
自溶（Ａｕｔｏｌｙｓｉｓ）法是一种特殊
的酶溶方式。控制温度、ｐＨ值、添加激活剂等条件，增强酵母自身所含的酶系统活性，酶解酵母细胞壁，使内容物流出。
酵母自溶时间较长，人们常常外加一些酶类来促进酵母壁的溶解，由于酶解专一性的限制，所以常用复合酶。
李祥等［１６］报道用自溶法水解酵母来实现工业化生产啤酒酵母抽提物，抽提率可达到７０％。赵郁［１７］在从酵母制备氨基酸时曾用蜗牛酶与蛋白酶联用进行细胞破壁。张晓明［１８］认为酵母破壁预处理技术能显著地
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加速酵母水解过程中蛋白质的溶出，在此基础上添加破壁复合酶效果更明显。廖鲜艳［１９］从啤酒废酵母提取蛋白质时曾用复合酶进行破壁处理，取得了较好的收率。
用酶法破壁时，常常存在产物抑制的问题，产物抑制会导致胞内物质释放率降低。例如甘露糖对蛋白酶有抑制作用。同时酶法破壁相对成本较高。
综上所述，酵母细胞破壁的方法有多种，但每种破碎方法都有一定的局限性，具体选择什么样的破壁方法要根据具体情况而定。为了加速酵母细胞壁的破裂，增加目的产物提取率，也有人将上述方法结合使用。用酵解酶（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）预处理面包酵母，然后高压匀浆，９５Ｍｐａ压力下匀浆４次，总破壁率接近１００％，而单独采用高压匀浆，同样条件下破壁率只有３２％［２０］。黄淑霞等曾报道采用高压均质法与盐法结合提取酵母核酸，使提取时间缩短，并且提高了核酸的得率。卞菁对从两种酵母（啤酒酵母和ＦＤＰ）中提取ＲＮＡ的工艺进行了比较，认为每一种菌体由于其各自特点不同，必须寻找合适的方法提取ＲＮＡ，才能获得高的收率与产品纯度。５展望
酵母菌是人类利用最早的微生物，通过生物技术去除其细胞壁后，再将酵母内蛋白质降解成氨基酸和多肽，核酸降解成核苷酸，并把它们和其他有效成分，如Ｂ族维生素、谷胱甘肽、微量元素等一起从酵母细胞中提取出来，制得人体可直接吸收利用的可溶性营养及风味物质的浓缩物，即酵母抽提物。该物质味道鲜美，具有营养、保健和调味３大功能，在食品领域内具有广阔的应用前景。目前，全世界众多国家如美国、日本、荷兰、丹麦等把天然调味料的研制与开发集中于酵母抽提物。其应用前景是非常乐观的。
研究表明从酵母中提取核酸是一项即经济又方便的核酸来源。目前随着核酸产业的兴起，许多保健品中都含有核酸，核酸同时还是许多药物的原料。
随着酵母综合利用研究的发展，酵母破壁技术日益成为大家关注的问题，对不同酵母采用适宜的破壁技术，从酵母中大量提取多种物质来满足社会生产的需要，对于促进我国经济发展和生态环境的
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改善都有重大意义。
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